海洋解脂耶羅威亞酵母菌產(chǎn)檸檬酸的研究.pdf

1、檸檬酸是一種重要的有機(jī)酸，在制藥業(yè)、食品業(yè)及化妝業(yè)等具有極多的用途，并對(duì)人體健康有一定的益處。工業(yè)檸檬酸主要是玉米、紅薯等糧食作物通過(guò)發(fā)酵方式獲得的。近年來(lái)世界糧食短缺，價(jià)格飛漲，使檸檬酸產(chǎn)品的低價(jià)優(yōu)勢(shì)不斷減小。木薯淀粉和菊粉是新型工業(yè)非糧食原料，其水解產(chǎn)物分別為葡萄糖和果糖，是生產(chǎn)檸檬酸的良好碳源，將這2種非糧食原料運(yùn)用于檸檬酸的工業(yè)生產(chǎn)，在降低成本、節(jié)約糧食資源和糧食安全等方面具有良好的應(yīng)用前景。
　　 目前，檸檬酸的工業(yè)生

2、產(chǎn)菌株主要是黑曲霉(Aspergillus niger)，但該菌發(fā)酵產(chǎn)酸易引起環(huán)境污染且其菌體結(jié)構(gòu)不利于遺傳改造。產(chǎn)酸酵母菌解脂耶羅威亞酵母(Yarrowia lipolytica)能彌補(bǔ)黑曲霉產(chǎn)酸的不足，因而成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。為了擴(kuò)大產(chǎn)酸酵母菌種的篩選范圍，我們對(duì)實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)保存120株海洋解脂耶羅威亞酵母菌進(jìn)行了篩選，獲得了1株高產(chǎn)檸檬酸的菌株Y.lipolyticaSWJ-1b(中國(guó)海洋微生物菌種保藏中心編號(hào)2E00068)。該菌

3、利用甘油(40.0 g/l)發(fā)酵產(chǎn)酸量為24.0±0.7g/l(檸檬酸生產(chǎn)力0.20g/lh)，高于陸地同種酵母菌相同條件下的發(fā)酵產(chǎn)酸量。通過(guò)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)該菌發(fā)酵產(chǎn)酸的最佳碳源為葡萄糖，其用于產(chǎn)酸培養(yǎng)的最適濃度為40.0 g/l，發(fā)酵產(chǎn)酸量為25.5±1.2 g/l(0.21 g/lh)。
　　 木薯淀粉(Cassava strach)應(yīng)用于檸檬酸生產(chǎn)的前提是產(chǎn)酸菌株必須具備水解木薯淀粉的能力，但Y.lipolytica SW

4、J-1b不能分泌淀粉酶，且外源淀粉酶(Amylase)基因在Y.lipolytica SWJ-1b中難以表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)扣囊復(fù)膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)IFO0111可以產(chǎn)生大量的淀粉酶，可使用該菌產(chǎn)生的淀粉酶先將木薯淀粉水解，所得木薯淀粉水解液(碳源濃度40.0 g/l)進(jìn)而被用于發(fā)酵產(chǎn)酸，其檸檬酸產(chǎn)量為29.4±0.3 g/l(0.25 g/lh)。而在2-1發(fā)酵罐中分批補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，檸

5、檬酸產(chǎn)量達(dá)60.2±1.8 g/l(0.21 g/l h)。
　　 最近幾年我們實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)菊粉(Inulin)也是發(fā)酵工業(yè)很好的原料，Y。lipolytica SWJ-1b同樣不能產(chǎn)生菊粉酶，為了使產(chǎn)酸菌株能夠直接利用菊粉發(fā)酵產(chǎn)酸以簡(jiǎn)化發(fā)酵生產(chǎn)工藝，我們將菊粉酶活力較高的馬克思克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)CBS6556的菊粉酶(Inulinase)基因成功整合至Y。lipolytica SWJ

6、-1b的基因組DNA，并通過(guò)表面展示技術(shù)將該基因表達(dá)的菊粉酶展示于Y.lipolytica SWJ-1b細(xì)胞表面，得到具穩(wěn)定菊粉酶活力的轉(zhuǎn)化菌株INU-87，其表面展示菊粉酶活力為22.6±0.8U/mg細(xì)胞干重，具有較高的外切酶活性。研究發(fā)現(xiàn)該表面展示菊粉酶與菌株K.marxianus的原始菊粉酶性質(zhì)基本一致，且表面展示技術(shù)的應(yīng)用使該酶易于回收利用。轉(zhuǎn)化菌株INU-87在菊粉培養(yǎng)基(菊粉濃度40.0g/l)中一步發(fā)酵產(chǎn)酸時(shí)，檸檬酸產(chǎn)量

7、為31.2±1.6g/l(0.26g/lh)，其在2-1發(fā)酵罐中發(fā)酵菊粉(100.0g/l)產(chǎn)酸量可達(dá)68.9±2.4 g/l(0.22g/lh)。轉(zhuǎn)化菌株INU-87以非糧原料菊粉一步發(fā)酵產(chǎn)檸檬酸，節(jié)約了糧食資源，降低了檸檬酸的生產(chǎn)成本，簡(jiǎn)化了非糧原料發(fā)酵產(chǎn)酸工藝，對(duì)檸檬酸的工業(yè)生產(chǎn)具有深遠(yuǎn)意義。
　　 產(chǎn)酸酵母菌最大的缺點(diǎn)在于發(fā)酵產(chǎn)酸過(guò)程中副產(chǎn)物異檸檬酸(Iso-citrateacid，ICA)產(chǎn)量和菌體油脂(Lipid)累

8、積量較高，對(duì)檸檬酸產(chǎn)量的提高極為不利。產(chǎn)酸代謝途徑中的異檸檬酸裂解酶(Iso-citrate lyase ICL)能夠減少異檸檬酸的產(chǎn)量，而ATP-檸檬酸裂解酶(ATP-citrate lyase ACL)則促進(jìn)油脂累積。為了減少發(fā)酵產(chǎn)檸檬酸過(guò)程中的副產(chǎn)物產(chǎn)量，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)轉(zhuǎn)化菌株INU-87 ACL1基因敲除和ICL1基因超表達(dá)，得到遺傳改良菌株IAI-30。該菌株的ACL1基因表達(dá)量降低了18.9％，受該基因控制的ACL酶活力明顯降低

9、；同時(shí)，其ICL1，基因表達(dá)量增加了259.4％，ICL酶活力有較大提高。經(jīng)測(cè)定遺傳改良菌株IAI-30的油脂累積量和副產(chǎn)物異檸檬酸的產(chǎn)量都明顯降低，其在菊粉產(chǎn)酸培養(yǎng)基(菊粉濃度40.0g/l)中發(fā)酵產(chǎn)酸量增至36.0±0.6g/l(0.30g/lh)。而遺傳改良菌株IAI-30在2-1發(fā)酵罐中一步發(fā)酵菊粉(100.0g/l)產(chǎn)酸量可達(dá)84.0±1.6g/l(0.39g/l h)。遺傳改良從基因水平上對(duì)產(chǎn)酸菌株的產(chǎn)酸代謝途徑做出了一定調(diào)