產(chǎn)還原型谷胱甘肽酵母菌的篩選及高產(chǎn)谷胱甘肽酵母工程菌的構(gòu)建.pdf

1、谷胱甘肽(GSH)是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸縮合而成的一種含有γ-谷氨?；蛶€基的生物活性三肽。GSH具有多種重要的生理功能。微生物發(fā)酵法是目前生產(chǎn)GSH最常用的方法，選用的菌種多為酵母。 從自然界中篩選到98株產(chǎn)還原型谷胱甘肽的酵母菌。其中2株(2053＃和ALJ036)GSH的產(chǎn)量相對較高，2053＃和ALJ036總GSH含量在發(fā)酵30h時達(dá)到最大值49.7mg/L和38.7mg/L。2053＃菌株與假絲酵母菌屬中

2、CandidaParapsilosis的18SrDNA基因序列同源性高達(dá)99.75％，結(jié)合常規(guī)生理生化鑒定結(jié)果，說明2053＃是CandidaParapsilosis的一個亞種，其18SrDNA基因序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中的登陸號為DQ218328。而另一株酵母ALJ036菌株經(jīng)生理生化試驗及18SrDNA鑒定為Saccharomycescerevisiae，其干細(xì)胞GSH含量達(dá)到了7.2mg/g。 利用PCR技術(shù)克隆了來源

3、于SaccharomycescerevisiaeALJ036的γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸合成酶(γ-glutamyl-cysteinesynthase)編碼基因gsh1，連接多拷貝表達(dá)載體pGAPZA，轉(zhuǎn)化Pichiapastorisx-33，構(gòu)建了重組菌Pichiapastorisx-33(pGAPZA-gsh1)；在高濃度Zeocin平板上篩選多拷貝陽性轉(zhuǎn)化子，并采用PCR的方法進(jìn)行驗證。對陽性轉(zhuǎn)化子的γ-glutamyl-cys

4、teinesynthase酶活力進(jìn)行了測定，結(jié)果顯示，重組酵母的γ-glutamyl-cysteinesynthase的酶活力是宿主菌的2.99倍，在液體YEPD中重組菌GSH的產(chǎn)量為42.2mg/L，是宿主菌的1.6倍。 考察了培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件對重組酵母合成GSH的影響：碳源和氮源的選擇及其濃度的優(yōu)化，磷酸鹽的影響，前體氨基酸的影響。優(yōu)化后的培養(yǎng)基組成為：甘油30g/L、蛋白胨40g/L、酵母膏9g/L、半胱氨酸0.36g/L