高產(chǎn)SOD乳酸菌、酵母菌菌株的選育及發(fā)酵條件優(yōu)化.pdf

1、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)是一類金屬酶，它廣泛存在于生物體內(nèi)，能夠催化生物體內(nèi)超氧陰離子發(fā)生歧化反應(yīng)，專一的清除生物體內(nèi)多余的超氧陰離子，平衡生物體內(nèi)的氧自由基。它可以防御氧毒性，增強(qiáng)機(jī)體抗輻射損傷能力，還可抗衰老，治療一些疾病(如腫瘤，炎癥及自身免疫疾病等等)。它在醫(yī)藥、食品、化妝品、及農(nóng)業(yè)中有廣泛的應(yīng)用前景，其制備和應(yīng)用廣受人們的關(guān)注與重視。 本文研究從產(chǎn)SOD的乳酸菌、酵母菌菌株選育

2、進(jìn)而使用誘變等方法提高SOD產(chǎn)量，得到產(chǎn)SOD能力較高的酵母菌菌株Y7-20、乳酸菌菌株L16-10，對(duì)其培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，最終在3.7 L生物反應(yīng)器中，對(duì)乳酸菌L16-10進(jìn)行分批發(fā)酵產(chǎn)SOD初探，再對(duì)生成的SOD進(jìn)行分離純化。 首先，從自然界中篩選出乳酸菌50株，酵母菌620株，對(duì)其進(jìn)行搖瓶發(fā)酵產(chǎn)SOD初篩，最終在節(jié)果皮表面篩選出一株酵母菌Y7，酵母菌搖床發(fā)酵產(chǎn)量最高為434.65 U/g，再通過紫外誘變和化學(xué)誘變，以及遺傳

3、穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，可得到一株遺傳性狀穩(wěn)定的菌株Y7-20，在優(yōu)化搖床發(fā)酵條件的情況下，最終可達(dá)1164.84U/g。同時(shí)，在乳酸菌中篩選出一株L16，在搖瓶條件下，SOD產(chǎn)量最高為3171.60U/g，再通過紫外誘變和化學(xué)誘變，獲得高產(chǎn)菌侏L16-10，其SOD產(chǎn)量可達(dá)到3394.60 U/g，所以選擇使用L16-10進(jìn)行液體發(fā)酵初探。 其次，通過對(duì)L16-10和Y7-20培養(yǎng)基組成和搖瓶培養(yǎng)條件進(jìn)行單因素試驗(yàn)，如培養(yǎng)基碳源、氮源、培

4、養(yǎng)溫度、pH值、搖床震蕩速度等篩選影響SOD產(chǎn)量的主要因素。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行改良。獲得乳酸菌L16-10適宜的培養(yǎng)條件為：乳糖為碳源，蛋白胨為氮源，pH6.5-7.0，搖床速度120 r/min，培養(yǎng)溫度為38℃，在此條件下L16-10搖瓶發(fā)酵最終產(chǎn)量可達(dá)3522.69 U/g。 再次，在搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，在3.7 L生物反應(yīng)器中進(jìn)行分批發(fā)酵初探，對(duì)發(fā)酵罐發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化(接種量、通氣量等)，結(jié)果表明：

5、5.0％的接種量、100 L/h通氣量適合SOD的發(fā)酵，在此條件下乳酸菌菌株L16-10產(chǎn)SOD的產(chǎn)量為124990 U/L。 最后，乳酸菌L16-10發(fā)酵濕菌體內(nèi)SOD經(jīng)分布純化，DE-52離子交換柱層析后，酶總活力收率為26.9％，雜蛋白去除率為99.6％，最終得到純化倍數(shù)67.32的3225.67 U/mg比活力的SOD蛋白。 此實(shí)驗(yàn)方法的優(yōu)點(diǎn)在于可在一般條件的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)對(duì)生活里常見幾種乳酸菌，酵母菌進(jìn)行一般的高產(chǎn)S