梨酒專用酵母的篩選及工程菌的構(gòu)建.pdf

1、以梨的果皮和梨園土壤作為分離源進(jìn)行梨酒酵母的分離、篩選,并將其中發(fā)酵性能較好(鑒定為純釀酒酵母)和產(chǎn)香性能較好(鑒定為非釀酒酵母)的兩株酵母作為兩親本,利用PF(Protoplast Fusion,原生質(zhì)體融合技術(shù))化學(xué)融合法進(jìn)行融合,選育出較原菌種生長繁殖速度快、發(fā)酵能力強(qiáng)、酒精產(chǎn)率高,同時兼?zhèn)涑鼍骑L(fēng)味濃厚、酒質(zhì)上乘且適合于梨酒專用的優(yōu)良菌株。
　　 通過對酵母菌富集培養(yǎng)和分離,再通過TTC平板一級篩選,杜氏發(fā)酵管二級篩選,三

2、角瓶發(fā)酵三級篩選,得到發(fā)酵性能較好的菌株YDJ05和產(chǎn)香性能較好的菌株YS03,并將其作為原生質(zhì)體融合的出發(fā)菌株。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明菌株YDJ05在梨汁中發(fā)酵能力較強(qiáng),產(chǎn)酒精能力較好,即發(fā)酵7d產(chǎn)酒率達(dá)到8.8%,且殘?zhí)禽^低,可作獨(dú)立的發(fā)酵菌株使用,經(jīng)過26SrDNAD1/D2區(qū)序列分析,鑒定為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),命名為Saccharomyces cerevisiae YDJ05;菌株YS03經(jīng)感官評

3、定產(chǎn)香能力較強(qiáng),并在梨汁中發(fā)酵第6d總酯含量達(dá)到0.38g/L,香氣最濃,經(jīng)過26SrDNAD1/D2區(qū)序列分析,鑒定為東方伊莎酵母(Issatchenkia orientalis),命名為Issatchenkia orientaIis YS03。
　　 將Saccharomyces cerevisiae YDJ05確定為原生質(zhì)體融合時發(fā)酵能力較好的親本菌株X;將Issatchenkia orientalisYS03通過EMS誘

4、變,得到了一株精氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株G1,將其確定為原生質(zhì)體融合時產(chǎn)香能力較好的親本菌株Y。將親本菌株X和Y采用蝸牛酶液在35℃下處理100min,得到最佳的原生質(zhì)體形成率及再生率,分別為:93.6%和94.2%,27.8%和31.6%。60℃水浴加熱滅活親本菌株X的原生質(zhì)體,確定滅活時間為14min。在以PEG-6000為促融劑的條件下對兩親本菌株的原生質(zhì)體進(jìn)行融合,得到DJ01～DJ06六株融合子,其中DJ02的產(chǎn)酒精率、產(chǎn)香率等指標(biāo)