梨酒酵母工程菌的構(gòu)建及SO2天然替代物的研究.pdf

1、梨是我國僅次于蘋果和柑橘的第三大水果,產(chǎn)量已經(jīng)躍居世界第一,但是目前以鮮食為主,出現(xiàn)了供過于求的矛盾。對(duì)梨進(jìn)行深加工是解決矛盾的有效手段,而開發(fā)梨酒是一種行之有效的解決方法。由于我國對(duì)于梨酒的加工技術(shù)不夠完善,故加大研究力度已經(jīng)成為研究者和生產(chǎn)者的當(dāng)務(wù)之急。另外,SO2是傳統(tǒng)果酒釀造常用的抗氧化劑及抗菌劑,至今仍然被使用。但是大量研究表明SO2會(huì)對(duì)人體造成危害,各國都要求降低SO2在果酒中的含量,故找到能夠替代SO2的安全、高效的方法已

2、經(jīng)引起了國內(nèi)外的關(guān)注。本文從梨皮及梨園土壤中分離得到了梨酒專用酵母,并通過原生質(zhì)體融合技術(shù)構(gòu)建了適合于梨酒釀造的優(yōu)良酵母工程菌。另外,從中草藥中篩選出了能夠替代SO2的天然替代物,并探討了天然替代物的抗氧化機(jī)理。同時(shí)對(duì)加入天然替代物后的梨酒香氣成分進(jìn)行了分析。以下為本論文主要內(nèi)容:
　　 1.本研究以梨園土壤及果皮為分離源,分離得到了279株酵母,通過TTC染色法篩選得到產(chǎn)酒精能力及產(chǎn)香能力較強(qiáng)的酵母46株。然后再利用杜氏管發(fā)酵

3、法二級(jí)篩選及三角瓶三級(jí)篩選得到了產(chǎn)酒率最高的菌株YDJ05和產(chǎn)香能力最強(qiáng)的菌株YS03,其產(chǎn)酒率和總酯含量分別為:8.8%(v/v)和0.38g/L。通過形態(tài)觀察及26SrDNAD1/D2區(qū)序列分析,兩株酵母分別鑒定為釀酒酵母和東方伊莎酵母,命名為SaccharomycescerevisiaeYDJ05和IssatchenkiaorientalisYS03。
　　 2.為了得到性能更加優(yōu)良、更適合于梨酒釀造的菌株,本課題通過原生

4、質(zhì)體融合技術(shù)構(gòu)建梨酒酵母工程菌,分別以菌株SaccharomycescerevisiaeYDJ05及IssatchenkiaorientalisYS03為融合親本X和Y。通過EMS誘變親本菌株Y,得到了一株精氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株,以此作為遺傳標(biāo)記。親本菌株X和Y采用蝸牛酶液在35℃下處理100min,得到最佳的原生質(zhì)體形成率及再生率,分別為:93.6%和94.2%,相對(duì)應(yīng)的原生質(zhì)體再生率分別為27.8%和31.6%。以加熱的方式滅活親本菌

5、株X,確定滅活時(shí)間為14min。在以PEG為促融劑的條件下對(duì)兩株菌進(jìn)行原生質(zhì)體融合,得到DJ01～DJ06六株融合子,其中DJ02的產(chǎn)酒精率、產(chǎn)香率等指標(biāo)最優(yōu),分別達(dá)到了9.87%和0.37g/L。通過26sDNAD1/D2區(qū)序列分析,融合子DJ02鑒定為釀酒酵母,命名為SaccharomycescerevisiaeDJ02。
　　 3.本部分以構(gòu)建的酵母工程菌SaccharomycescerevisiaeDJ02作為釀造菌株,

6、并對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行詳細(xì)的優(yōu)化,結(jié)果如下:
　　 利用單因素實(shí)驗(yàn)初步確定了基本發(fā)酵條件為:裝液量80mL、接種量11%、初始pH值5.5、培養(yǎng)溫度20℃、發(fā)酵時(shí)間7d。
　　 通過添加中草藥刺激因子,發(fā)現(xiàn)砂仁、枸杞、杜仲、苦參、厚樸和陳皮六種中草藥對(duì)該菌體出酒率有顯著的影響,其中砂仁的刺激作用最為明顯,出酒率達(dá)到了10.57%。
　　 通過Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在培養(yǎng)溫度、裝液量、初始pH值、接種

7、量、發(fā)酵時(shí)間、苦參濃度、砂仁濃度、杜仲濃度、陳皮濃度、厚樸濃度、枸杞濃度等因素中五個(gè)影響顯著的因素分別為:培養(yǎng)溫度、裝液量、初始‘pH值、發(fā)酵時(shí)間以及砂仁濃度。
　　 通過Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)對(duì)影響出酒率顯著的5個(gè)因素進(jìn)一步優(yōu)化,采用響應(yīng)面方法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析,得到培養(yǎng)溫度、裝液量、初始pH值、發(fā)酵時(shí)間以及砂仁濃度的最佳值分別為:23.2℃、76.5mL、5.77、7.6d和1.0%,此時(shí)出酒率為11.94%,比

8、未優(yōu)化之前提高了21%。
　　 4.從抗菌及抗氧化兩個(gè)角度出發(fā),尋找能夠替代SO2的中草藥,并對(duì)其抗氧化機(jī)理進(jìn)行探討。以53種具有潛在抗菌性能的中草藥作為研究對(duì)象,通過單因素和組合實(shí)驗(yàn)篩選出地菜子、栝樓、酸棗仁和虎杖四種中草藥具有較強(qiáng)的抗菌性能,與SO2相接近。研究表明其最適添加量為3mL/100mL(3%)。
　　 挑選出40種具有潛在抗氧化能力的中草藥,通過總還原力、DPPH·的清除實(shí)驗(yàn)、O2-·的清除和·OH的清除

9、實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)花生殼、槐花等9種中草藥具有較強(qiáng)的抗氧化性。將上述中草藥加入到梨酒中,利用福林酚法測定梨酒的多酚含量,發(fā)現(xiàn)花生殼、丁香和丹參在梨酒內(nèi)具有較強(qiáng)的抗氧化能力。
　　 將具有較強(qiáng)的抗菌及抗氧化能力的中草藥組合,分析其抗氧化性和抗菌性能,再通過釀造菌種的適應(yīng)性實(shí)驗(yàn),得出“酸棗仁＋丁香”同時(shí)具有較強(qiáng)的抗氧化和抗菌能力,其添加量為3%(各1.5%),作為梨酒中SO2的天然替代物。通過定量實(shí)驗(yàn)分析,能替代70%的SO2。
　　

10、 分析SO2天然替代物的抗氧化機(jī)理發(fā)現(xiàn),梨酒中加入該替代物后,其氧化還原電位明顯降低,低的氧化還原電位可以減慢多酚類物質(zhì)的氧化。另外,梨酒在加入“酸棗仁+丁香”后,多酚的相對(duì)聚合度明顯降低,從而減少羥基自由基的產(chǎn)生,進(jìn)而抑制梨酒中多酚的氧化。
　　 5.梨酒中加入SO2天然替代物后,采用GC-MS分析得到該梨酒的主要香氣成分,結(jié)果如下:含有正丁醇、苯乙醇等醇類12種,占總香氣成分的17.92%;含有甲基丙醇二酸、己酸等酸類物質(zhì)

11、20種,占總香氣成分的9.14%;含有辛酸乙酯、琥珀酸氫乙酯、磷酸三丁酯等酯類物質(zhì)為19種,占總香氣量的14.23%;含有2,3-二羥基苯并呋喃、3-羥基-1-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-1-丙酮等8種酮類物質(zhì),含量為1.22%;含有十五烷、2,6,10-三甲基十四烷等烷烴類物質(zhì)有14種,含量為1.66%;含有3種苯類物質(zhì),分別為1-乙基丁基苯、二丁羥基甲苯、2.丙烯基-1,4二甲氧基-3-甲基苯,其含量為0.36%;含有丁香酚、對(duì)特

12、辛基苯酚等多酚類物質(zhì)6種,其含量高達(dá)22.45%;含有4種酰胺類物質(zhì),分別為油酸酰胺、芥酸酰胺、N,N-二甲基平二酰胺和十二烷基酰胺,含量為16.57%;還含有苯乙烯、2,6-二異丙基-茴香醚、1,6-二甲基-4-異丙基-萘和1-十九碳烯四種物質(zhì),含量為總香氣成分的4.07%。與傳統(tǒng)釀造中全部加入SO2的對(duì)照梨酒相比較,香氣成分的種類及含量差別不大,滋味、口感等感官指標(biāo)相近。故可以得出結(jié)論:“酸棗仁＋丁香”作為SO2替代物是可行的,可以