釀酒酵母和解脂耶氏酵母異檸檬酸脫氫酶磷酸化調控機制研究.pdf

1、異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase,IDH)是三羧酸循環(huán)中的關鍵酶之一，與NAD(P)+結合，催化異檸檬酸氧化脫羧生成α-酮戊二酸、CO2和NAD(P)H。IDH在生物合成、能量代謝以及抗氧化等方面發(fā)揮重要作用。根據系統(tǒng)發(fā)生分析，可將IDH家族蛋白分為I型、II型和單體型三大IDH亞家族。
　　研究發(fā)現(xiàn)，來自大腸桿菌(Escherichia coli)的異檸檬酸脫氫酶(EcIDH)受磷酸化作用的調節(jié)，

2、EcIDH的可逆磷酸化作用控制著細胞內的碳通量在TCA循環(huán)和乙醛酸旁路中的分配。當大腸桿菌處于乙酸等貧瘠碳源環(huán)境時，EcIDH中位于第113位的絲氨酸(Ser113)會被一個雙功能酶，即異檸檬酸脫氫酶激酶/磷酸酶(IDHkinase/phosphatase,IDHK/P)磷酸化，導致其喪失約75％的活性，迫使碳源流入乙醛酸旁路。EcIDH的磷酸化調控機制只在一些細菌中存在，而真核生物基因組中不存在IDHK/P同源序列，因此認為真核生物I

3、DH不能受磷酸化的調控。
　　基于結構的真核生物和原核生物IDH序列比對顯示，不同來源的IDH中都含有與EcIDH的Ser113相對應的保守Ser。在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) IDH(ScIDH)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)IDH(YlIDH)的序列中，也有與之相應的關鍵Ser，分別是Ser95和Ser103。ScIDH和YlIDH是NADP+依賴型IDH，屬于II型

4、IDH亞家族成員。
　　IDH的磷酸化調控機制研究主要集中于I型IDH，為了研究保守的Ser在真核生物II型IDH中的作用，本研究通過定點突變，將Ser95和Ser103分別突變成Asp(D)和Glu(E)，以模擬IDH的持續(xù)磷酸化狀態(tài)，得到了ScIDH突變體體酶S95D及S95E和YlIDH突變體體酶S103D及S103E。另外，為了研究該絲氨酸位點上不同側鏈基團對IDH活性的影響，我們分別將ScIDH和YlIDH中絲氨酸突變?yōu)?/p>

5、帶有不同側鏈基團的甘氨酸、丙氨酸、蘇氨酸和酪氨酸。將2個野生型酶ScIDH和YlIDH，以及12個突變體酶進行原核表達、純化、酶動力學參數的測定。SDS-PAGE結果顯示，野生型酶和突變體酶的亞基分子量均為45 kDa左右。CD光譜分析的結果顯示，野生型酶和突變體酶的二級結構十分相似，說明突變并沒有引起ScIDH和YlIDH的二級結構的改變。酶動力學參數的測定結果顯示，模擬磷酸化狀態(tài)的4個突變體酶(S95D、S95E、S103D和S10

6、3E)的酶活大幅下降，幾乎完全失活。另外8個突變體酶的活性也明顯降低，說明Ser95或Ser103被含不同側鏈基團的氨基酸取代，會嚴重影響IDH的活性。4個ScIDH突變體酶S95T、S95G、S95A和S95Y的活性分別只有野生型酶的38.07％、3.24％、2.65％和0.01％；4個YlIDH突變體酶S103T、S103G、S103A、S103Y的酶活分別只有野生型酶的44.26％、27.99％、16.29％和0.01％。實驗結果

7、表明Ser95和Ser103分別是ScIDH和YlIDH中潛在的磷酸化位點，對酶與底物的結合至關重要。
　　EcIDH的Ser113受磷酸化作用調控的結構基礎，是Ser113及其相鄰氨基酸殘基形成的磷酸化環(huán)(phosphorylation Loop,P-loop)和IDH激酶/磷酸酶(IDHK/P或AceK)的識別片段(AceK recognition segment,ARS)。Ser113被磷酸化后，其空間結構發(fā)生變化，與底物異

8、檸檬酸結合的部位變得較為狹窄，阻礙了EcIDH與異檸檬酸的結合。人細胞質IDH(HcIDH)也可以通過調節(jié)片段(regulatory segment)來調節(jié)自身的活性，由于構象的改變，導致HcIDH無法與底物異檸檬酸相結合，其調節(jié)方式在一定程度上類似于EcIDH的磷酸化作用機制。
　　基于結構的蛋白質序列比對分析顯示，ScIDH、YlIDH及HcIDH中，與EcIDH的P-loop相對應的位置都插入了一段氨基酸序列，這些插入序列形

9、成短的α-螺旋結構，可能影響IDHK/P對底物IDH的識別與結合?；蚪M序列分析顯示，在人、釀酒酵母和解脂耶氏酵母的基因組中沒有IDHK/P同源序列。但是HcIDH中的調節(jié)片段在真核生物和原核生物IDH中都很保守。因此，關于IDH磷酸化機制的進化起源，我們提出了可能的假設：一種是，古老的IDH包含磷酸化環(huán)、識別片段及調節(jié)片段，后來在環(huán)境的選擇壓力下，一些物種IDH中與磷酸化作用相關的磷酸化環(huán)及識別片段的功能被篩選出來，如EcIDH的磷酸

10、化調控機制，而有些物種IDH中調節(jié)片段的潛在功能被篩選出來，如HcIDH的自我調控機制；另一種是，古老的IDH磷酸化機制與IDHK/P同時存在，但在進化過程中，一些生物體因長期不用而逐漸丟失了IDH磷酸化調控機制及IDHK/P，同時一些真核生物IDH演化出多種同工酶，以及更為經濟有效的自我調節(jié)模式。由于磷酸化機制可能出現(xiàn)在輔酶特異性分化之前(數據未發(fā)表)，因此HcIDH的自我調控機制很可能是從磷酸化調控機制演化而來。
　　本研究已