產(chǎn)甘油假絲酵母胞漿3-磷酸甘油脫氫酶基因CgGPD啟動(dòng)子在釀酒酵母中的功能分析.pdf

1、產(chǎn)甘油假絲酵母WL2002-5具有耐高滲并且高產(chǎn)甘油的特性，已被廣泛用于甘油的工業(yè)化生產(chǎn)。自實(shí)現(xiàn)工業(yè)化以來(lái)，為了進(jìn)一步提高其產(chǎn)量性狀，本中心著重在菌種和其關(guān)鍵酶表達(dá)以及發(fā)酵工藝等方面做了大量的工作，至今仍未取得實(shí)質(zhì)性突破，最可能的原因是我們對(duì)其遺傳背景知之甚少，亟待完善。為了進(jìn)一步提高產(chǎn)甘油假絲酵母的產(chǎn)量性狀，完善其遺傳背景研究，闡明其高產(chǎn)甘油的機(jī)理，由于胞漿3-磷酸甘油脫氫酶是甘油合成途徑中的關(guān)鍵酶，因此本課題組通過(guò)簡(jiǎn)并PCR技術(shù)首次

2、從產(chǎn)甘油假絲酵母克隆到編碼產(chǎn)甘油假絲酵母胞漿3-磷酸甘油脫氫酶基因CqGPD，與釀酒酵母GPD1基因相比對(duì)，發(fā)現(xiàn)二者的同源性只有54.15％，表明產(chǎn)甘油假絲酵母的CgGPD基因是一個(gè)新的基因，因此弄清它的分子機(jī)理將可能為解釋該菌株高轉(zhuǎn)化率、高產(chǎn)甘油提供一個(gè)重要的依據(jù)，同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)CgGPD是一種滲透壓調(diào)節(jié)基因，所以懷疑其啟動(dòng)子PCggpd受滲透壓調(diào)控，故本研究根據(jù)已獲得的CgGPD的相關(guān)序列設(shè)計(jì)引物，用PCR技術(shù)克隆出該基因的啟動(dòng)子P

3、Cggpd，通過(guò)比對(duì)發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子與來(lái)自釀酒酵母GPD1的啟動(dòng)子在序列特征上存在明顯差異，兩者同源性僅有28.75％，說(shuō)明PCggpd是一個(gè)全新的啟動(dòng)子。 為了更好地對(duì)PCggpd的功能進(jìn)行分析，本研究克隆了來(lái)自于水母的綠色熒光蛋白基因gfp，構(gòu)建了含報(bào)告基因gfp的重組表達(dá)載體pYX212-zeocin-PCggpd-gfp，電擊轉(zhuǎn)入釀酒酵母W303-1A中，然后將重組型釀酒酵母置于含不同濃度的NaCl、KCl、葡萄糖、甘露醇、

4、山梨醇等滲透壓調(diào)節(jié)劑的YEPD培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，檢測(cè)PCggpd啟動(dòng)報(bào)告基因gfp表達(dá)的差異。通過(guò)熒光檢測(cè)表明，PCggpd不僅成功啟動(dòng)了gfp的表達(dá)，而且在不同滲透壓條件下，gfp的表達(dá)存在明顯差異。這主要是由于啟動(dòng)子PCggpd對(duì)不同滲透壓的響應(yīng)情況引起。在高滲條件下熒光蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，說(shuō)明高滲條件對(duì)PCggpd具有很強(qiáng)誘導(dǎo)作用。從PCggpd受高滲條件誘導(dǎo)以及隨著滲透壓的提高誘導(dǎo)作用隨之增強(qiáng)的特性可以看出PCggpd很可能是產(chǎn)甘

5、油假絲酵母在高滲條件下高轉(zhuǎn)化率、高產(chǎn)甘油的重要因素之一，這將對(duì)完善產(chǎn)甘油假絲酵母的遺傳背景，闡明其高產(chǎn)甘油的機(jī)理具有重要意義。 為了進(jìn)一步驗(yàn)證啟動(dòng)子的PCggpd的功能，將誘導(dǎo)型啟動(dòng)子PCggpd在抗性育種和異源蛋白表達(dá)等方面得以應(yīng)用，本研究進(jìn)行了初步探索。首先克隆了不含信號(hào)肽的來(lái)自于枯草芽孢桿菌的α-淀粉酶基因amy，構(gòu)建了釀酒酵母游離型重組表達(dá)載體pYX212-zeocin-PCggpd-amy，即將α-淀粉酶基因amy置于