產(chǎn)甘油假絲酵母胞漿3-磷酸甘油脫氧酶基因的克隆、表達(dá)與功能鑒定.pdf

1、產(chǎn)甘油假絲酵母(Candidaglycerinogenes)是優(yōu)良的甘油生產(chǎn)菌株，并且已成功的應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中。研究者在產(chǎn)甘油假絲酵母菌株的生理生化、發(fā)酵T藝優(yōu)化、代謝機(jī)理方面開展了卓有成效的研究。但是與釀酒酵母(Saccharomvcescerevisiae)等模式菌株相比，該工業(yè)菌株的遺傳和分子生物學(xué)信息比較匱乏。在C.glycerinogenes中，甘油合成途徑的關(guān)鍵酶—胞漿3-磷酸甘油脫氫酶的編碼基因以及該基因在細(xì)胞中的具體的生

2、理功能是未知的。為此，本文從產(chǎn)甘油假絲酵母基因組中克隆出甘油合成的關(guān)鍵酶基因，并對(duì)其進(jìn)行了詳細(xì)的功能鑒定，最后通過在C.glyerinogenes過表達(dá)和缺失研究進(jìn)一步確定該基因在細(xì)胞過量合成甘油中的作用。本文主要研究成果概括如下： (1)利用PCR方法，克隆了C.glycerinogenes的胞漿NAD+依賴的3-磷酸甘油脫氫酶編碼基因(CgGPD)。1167nt的開放閱讀框編碼一個(gè)分子量為43kDa，包含388個(gè)氨基酸的蛋白

3、，氨基酸水平上該基因與具有安格斯畢赤酵母相似性最高，為70.9％，與粟酒裂殖酵母相對(duì)較低，僅為46.7％。并且發(fā)現(xiàn)在產(chǎn)甘油假絲酵母基因組中僅有一個(gè)CgGPD基因，不存第二個(gè)同功異構(gòu)酶編碼基因。 (2)CgGPD基因在gpd1/gpd2和gpd1釀酒酵母突變株中表達(dá)能夠顯著提高細(xì)胞耐滲透壓能力和甘油合成能力，表明CgGPD基因能夠完全功能互補(bǔ)釀酒酵母GPD1基因的缺失。滲透壓誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)表明CgGPD基因的表達(dá)受到滲透壓的生理調(diào)控。在

4、野生型釀酒酵母中過量表達(dá)CgGPD基因能夠大幅度提高細(xì)胞的甘油合成能力，同時(shí)結(jié)果表明CgGPD基因自身上游調(diào)控序列能夠有效調(diào)控基因表達(dá)。 (3)CgGPD和GPD2基因能夠提高h(yuǎn)og1細(xì)胞的耐滲性，而GPD1基因的表達(dá)對(duì)突變株的耐高滲透壓能力并沒有顯著提高：在pbs2突變株中分別過量表達(dá)CgGPD、GPD1和GPD2基因都能夠提高轉(zhuǎn)化子在高滲壓條件下的生長(zhǎng)性能；過量表達(dá)CgGPD和GPD1能夠使gpd1/gpd2突變株降低對(duì)滲透

5、壓的敏感性，GPD2基因的表達(dá)則不具這種顯著的這種功能：在hog1和pbs2突變株中分別過量表達(dá)CgGPD、GPD1和GPD2基因均能使轉(zhuǎn)化子細(xì)胞在滲透壓刺激下誘導(dǎo)胞內(nèi)甘油合成和積累；GPD1基因的過量表達(dá)僅能一定程度上互補(bǔ)gpd1/gpd2突變株細(xì)胞在厭氧環(huán)境中GPD2基因的功能，而過量表達(dá)CgGPD基因則能夠完全功能互補(bǔ)GPD2基因的缺失。 (4)根據(jù)同源重組原理，以含有腐草霉素(Zeocin)抗性基因的pGAPZb質(zhì)粒為基

6、本構(gòu)架，以CgURA3基因作為整合位點(diǎn)構(gòu)建了用于轉(zhuǎn)化產(chǎn)甘油假絲的酵母的整合載體；分別優(yōu)化了物理參數(shù)和細(xì)胞生理參數(shù)對(duì)電轉(zhuǎn)化效率的影響。結(jié)果表明，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期的細(xì)胞經(jīng)DTT或LiAc預(yù)處理后在2×109個(gè)/mL的細(xì)胞濃度下加入200μg的線性整合載體，在1600V電壓下，200Ω電阻、25μF電容進(jìn)行電擊，獲得的轉(zhuǎn)化效率可達(dá)到394個(gè)轉(zhuǎn)化子/μgDNA。 (5)以腐草霉素抗性基因作為選擇標(biāo)記，分別構(gòu)建CgGPD基因敲除載體pUC—g

7、pd—Zeoin和同源表達(dá)載體pGA—rDNA—CgGPD，導(dǎo)入產(chǎn)甘油假絲酵母細(xì)胞，獲得穩(wěn)定的缺失突變株和過表達(dá)轉(zhuǎn)化子。甘油發(fā)酵實(shí)驗(yàn)表明CgGPD基因缺火顯著降低了細(xì)胞的甘油合成能力，同時(shí)增加了細(xì)胞的產(chǎn)乙醇能力，而細(xì)胞的EMP代謝途徑活力的降低導(dǎo)致細(xì)胞量顯著下降，使得細(xì)胞在高濃度葡萄糖下的生長(zhǎng)能力受損；過量表達(dá)CgGPD基因能夠加速葡萄糖的消耗，縮短發(fā)酵周期，從而提高甘油的產(chǎn)率和得率，同時(shí)胞內(nèi)副產(chǎn)物丙酮酸、乙酸和乳酸等有一定的提高，而乙