產(chǎn)黃青霉阿魏酸酯酶基因的克隆及在畢赤酵母中的表達(dá).pdf

1、阿魏酸酯酶和木聚糖酶協(xié)同作用去水解植物細(xì)胞壁材料中以酯鍵相連的阿魏酸和雙阿魏酸，因此該酶在降解植物生物質(zhì)資源方面發(fā)揮主導(dǎo)作用。產(chǎn)生阿魏酸酯酶的微生物來源十分廣泛，然而出發(fā)菌株的阿魏酸酯酶活性很低，因此限制了該酶的產(chǎn)業(yè)化及在各個領(lǐng)域的應(yīng)用。本文以1株產(chǎn)阿魏酸酯酶的產(chǎn)黃青霉HA4089為研究材料，通過分子生物學(xué)手段，構(gòu)建基因工程菌株來提高阿魏酸酯酶的產(chǎn)量。
　　采用PCR技術(shù)克隆得到產(chǎn)黃青霉HA4089的阿魏酸酯酶A的基因序列。測序發(fā)

2、現(xiàn)該基因長度為933bp，包含2個外顯子和1個內(nèi)含子。利用重疊拼接PCR技術(shù)成功將產(chǎn)黃青霉HA4089的阿魏酸酯酶A的兩個外顯子拼接，獲得不含內(nèi)含子的阿魏酸酯酶A cDNA基因。經(jīng)EcoRI和AvrII雙酶切，成功構(gòu)建畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K-PcfaeA。測序分析表明：阿魏酸酯酶A基因序列長度為783bp，共編碼260個氨基酸。與NCBI報(bào)道的產(chǎn)黃青霉阿魏酸酯酶A的同一性為97.69％，共有6處差異，分別是第12位的K（賴氨酸），

3、第30位的R（精氨酸），第49位的Y（酪氨酸），第170位的L（亮氨酸），第211位的V（纈氨酸），第245位的E（谷氨酸）。
　　將表達(dá)載體 pPIC9K-PcfaeA經(jīng)線性化后，利用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化畢赤酵母 GS115菌株，獲得faeA轉(zhuǎn)化子。通過觀察faeA轉(zhuǎn)化子在阿魏酸乙酯平板上產(chǎn)生透明圈的情況，篩選出5株產(chǎn)生明顯透明圈的faeA轉(zhuǎn)化子。然后分別提取染色體DNA，并以其作為模板，PCR鑒定進(jìn)行復(fù)篩，結(jié)果獲得4株faeA轉(zhuǎn)化子。

4、測定4株faeA轉(zhuǎn)化子酶活，其中酶活最高的3＃轉(zhuǎn)化子，活力達(dá)到20.67 U/mL。SDS-PAGE蛋白電泳分析顯示在大小32 KDa處有一條明顯的條帶，說明產(chǎn)黃青霉的阿魏酸酯酶A基因在畢赤酵母中表達(dá)成功。阿魏酸酯酶粗酶性質(zhì)的研究表明其最適作用溫度為50℃，最適pH值為4.5，在50℃保溫20min后酶活力仍為90%以上，在pH4.0-6.0的范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好，酶活力仍為90%以上。
　　采用PCR克隆得到產(chǎn)黃青霉阿魏酸酯酶C的基

5、因，序列分析發(fā)現(xiàn)其總長度為750bp，沒有內(nèi)含子，可直接用于外源表達(dá)。用EcoR I和Avr II雙酶切將阿魏酸酯酶C基因插入到表達(dá)載體pPIC9K中，成功構(gòu)建畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K-PcfaeC。測序分析顯示產(chǎn)黃青霉 HA4089的阿魏酸酯酶 C基因序列長度為762bp，共編碼249個氨基酸，其中與NCBI報(bào)道的阿魏酸酯酶C序列只有1個氨基酸的差異，第24位的組氨酸被 Y（酪氨酸）取代，經(jīng)分析該氨基酸的差異不影響后續(xù)的表達(dá)。表達(dá)

6、載體pPIC9K-PcfaeC經(jīng)線性化后，電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115菌株，通過阿魏酸乙酯平板法，篩選出6株產(chǎn)生明顯透明圈的轉(zhuǎn)化子。PCR鑒定獲得5株faeC轉(zhuǎn)化子，測定5株faeC轉(zhuǎn)化子酶活，其中酶活最高的4＃轉(zhuǎn)化子，活力達(dá)到20.14 U/mL。SDS-PAGE蛋白電泳分析，結(jié)果顯示在大小32 KDa處有一條明顯的條帶，說明產(chǎn)黃青霉的阿魏酸酯酶C基因在畢赤酵母中表達(dá)成功。對重組FAE C粗酶性質(zhì)的研究表明產(chǎn)阿魏酸酯酶C最適作用溫度