臺(tái)灣乳白蟻產(chǎn)阿魏酸酯酶共生菌的篩選及其功能基因的克隆與表達(dá).pdf

1、生物質(zhì)能源是一種新能源，其與常規(guī)化石燃料相比，具有儲(chǔ)量豐富、可再生以及環(huán)保等特點(diǎn)，生物質(zhì)能源的開發(fā)與利用具有重要的能源戰(zhàn)略意義。然而，天然木質(zhì)纖維素的難降解性極大地限制了其可利用性，高效的生物質(zhì)能源轉(zhuǎn)化方式對(duì)其開發(fā)與利用無疑有著重大意義。經(jīng)過長(zhǎng)期的進(jìn)化和演變，白蟻生物系統(tǒng)憑借其獨(dú)特的木質(zhì)纖維素降解酶系及其協(xié)調(diào)機(jī)制對(duì)木質(zhì)纖維素展現(xiàn)出高效轉(zhuǎn)化與利用的功能。其中，阿魏酸酯酶能夠打開木質(zhì)纖維素內(nèi)相互交聯(lián)的阿魏酸酯鍵，修飾充填在纖維素和半纖維素之

2、間木質(zhì)素，使生物質(zhì)原料易于降解，在木質(zhì)纖維素致密結(jié)構(gòu)的解聚過程中發(fā)揮了十分重要的作用。因此，本文以臺(tái)灣乳白蟻（Coptotermes formosanus）生物系統(tǒng)作為研究對(duì)象，從該白蟻腸道系統(tǒng)中分離能夠產(chǎn)生阿魏酸酯酶的共生細(xì)菌。其主要研究?jī)?nèi)容包括以下三個(gè)方面:①利用平板透明圈法從臺(tái)灣乳白蟻腸道中篩選能夠產(chǎn)生阿魏酸酯酶的細(xì)菌;②選擇產(chǎn)酶能力較強(qiáng)的菌株，對(duì)其產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化;③克隆并異源表達(dá)所選高效產(chǎn)酶菌株的阿魏酸酯酶基因。本文主要研究結(jié)

3、果歸納如下:
　　(1)從臺(tái)灣乳白蟻腸道中成功篩選出六類（A類～F類）可產(chǎn)生阿魏酸酯酶的共生細(xì)菌，選擇其中一株產(chǎn)阿魏酸酯酶能力較強(qiáng)的菌株(D2)進(jìn)行后續(xù)研究，通過16S rDNA基因序列的比對(duì)，確定其為Burkholderia屬的一株細(xì)菌。
　　(2)通過對(duì)菌株D2的產(chǎn)阿魏酸酯酶條件進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化，明確了該菌株如下的最優(yōu)產(chǎn)酶條件:碳源阿魏酸乙酯，氮源硫酸銨，菌體接種量5％(v/v)，培養(yǎng)基初始pH7.0，產(chǎn)酶溫度25℃，產(chǎn)酶時(shí)

4、間2天。優(yōu)化菌株D2產(chǎn)酶條件后發(fā)現(xiàn)，其粗酶液對(duì)阿魏酸乙酯的酶活提高了6.6倍;對(duì)比優(yōu)化后粗酶液對(duì)人工合成模式底物阿魏酸乙酯(EFA)和天然底物去淀粉麥麩(DSWB)的酶活，發(fā)現(xiàn)后者酶活約為前者酶活的33倍（測(cè)定后者酶活時(shí)，需向粗酶液中添加木聚糖酶），說明菌株D2產(chǎn)生的阿魏酸酯酶對(duì)天然底物(DSWB)具有更強(qiáng)的水解能力。
　　(3)利用設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物，成功的克隆出菌株D2的阿魏酸酯酶基因。目的基因連接至pEASY-E2表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)