產(chǎn)堿性蛋白酶海洋細菌的篩選及其基因克隆.pdf

1、本研究從福建海域的海水、海泥及海藻樣品中分離到三株產(chǎn)堿性蛋白酶的海洋細菌菌株3B、6CW、15E，采用16SrDNA分子生物學(xué)鑒定結(jié)合細菌的常規(guī)鑒定方法，確認分離到的三個產(chǎn)蛋白酶的海洋細菌菌株分別是熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)，粘質(zhì)沙雷菌(Serratiamarcescens)，氧化短桿菌(Brevibacteriumoxydans)。其中，海洋氧化短桿菌(Brevibacteriumoxydans)產(chǎn)堿

2、性蛋白酶為首次報道。 對氧化短桿菌15E菌株產(chǎn)堿性蛋白酶的發(fā)酵條件進行研究，結(jié)果表明：在2％接種量、培養(yǎng)基的初始pH為9.0、裝液量在20％左右、培養(yǎng)溫度為28℃、搖床轉(zhuǎn)速為200r/min的條件下培養(yǎng)40h時，菌體生長最適且總酶活達到最大；菌株在添加有0.5％牛肉膏、0.1％葡萄糖的酪蛋白培養(yǎng)基中生長和產(chǎn)酶均達到最佳；人工海水中的K+、Ca2+和Mg2+濃度較為適合15E菌株生長和產(chǎn)酶，其中K+對菌株產(chǎn)酶起關(guān)鍵作用。

3、菌株15E所分泌的堿性蛋白酶的分子量為49.0kDa，等電點為9.3，米氏常數(shù)Km為5.6×10-3g/mL。該酶的最適作用溫度為60℃，最適pH值為7.0-9.0；Ca2+、Mg2+、K+對酶有激活作用。酶對一些變性劑如SDS、尿素、鹽酸胍具有一定的耐受性；PMSF和AEBSF能抑制該蛋白酶，表明該酶屬于絲氨酸蛋白酶；EDTA對該蛋白酶有抑制作用，說明該蛋白可能含有金屬離子。 氧化短桿菌(Brevibacteriumoxyda

4、ns)菌株15E堿性蛋白酶apr基因克隆結(jié)果表明，該DNA片段長度為1357nt，最大開放閱讀框編碼447個氨基酸。從第122個氨基酸到第144個氨基酸這段序列可能是一個跨膜區(qū)。但是，獲得的序列經(jīng)分析并未存在特征明顯的信號肽序列。利用系統(tǒng)發(fā)育樹分析，所克隆的序列與褐色高溫單胞菌堿性蛋白酶前導(dǎo)序列和銅綠假單胞菌堿性蛋白酶基因處于同一個分支，說明該序列為編碼堿性蛋白酶的基因。同源性分析結(jié)果顯示，該蛋白可能是一個結(jié)合蛋白酶類，存在一個活性中心