短小芽桿菌堿性蛋白酶酶學(xué)特性及其酶基因克隆、表達(dá)的研究.pdf

1、隨著畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，我國(guó)蛋白質(zhì)飼料持續(xù)短缺，新型蛋白質(zhì)飼料資源的開(kāi)發(fā)變得越來(lái)越緊迫。新型蛋白質(zhì)飼料的開(kāi)發(fā)技術(shù)主要是利用現(xiàn)代生物技術(shù)將一些利用率低的飼料資源或非常規(guī)飼料資源變?yōu)樾滦偷鞍罪暳?，提高其利用率。現(xiàn)代生物技術(shù)在開(kāi)發(fā)利用新型蛋白質(zhì)飼料方面主要應(yīng)用發(fā)酵工程技術(shù)生產(chǎn)發(fā)酵飼料、酶工程技術(shù)生產(chǎn)酶解飼料等。無(wú)論是發(fā)酵工程技術(shù)還是酶工程技術(shù)都涉及微生物資源或微生物酶資源的開(kāi)發(fā)與利用。利用發(fā)酵技術(shù)或酶技術(shù)在以羽毛粉為對(duì)象開(kāi)發(fā)新型蛋白質(zhì)飼料的過(guò)

2、程中篩選各種細(xì)菌、真菌和放線菌。其中細(xì)菌以芽孢桿菌屬細(xì)菌居多，該菌屬細(xì)菌多數(shù)產(chǎn)堿性蛋白酶，已有大量的堿性蛋白酶被開(kāi)發(fā)應(yīng)用于各種工業(yè)生產(chǎn)。目前，在羽毛角蛋白降解方面還僅處于酶的分離與純化的研究，如何采用基因工程技術(shù)提高酶的產(chǎn)量是當(dāng)今的研究熱點(diǎn)。本試驗(yàn)在本實(shí)驗(yàn)室前期微生物菌種資源篩選的基礎(chǔ)上對(duì)比研究血紅蛋白降解菌短小芽孢桿菌NJM4和角蛋白降解菌短小芽孢桿菌WHK產(chǎn)蛋白酶性質(zhì)，從中選取產(chǎn)蛋白酶活力較高的WHK4菌株作為研究素材，對(duì)其蛋白酶進(jìn)

3、行分離純化，并對(duì)蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，深入了解該酶的特性，為今后的開(kāi)發(fā)利用奠定理論基礎(chǔ)。同時(shí)對(duì)于如何提高NJM4的產(chǎn)酶能力本試驗(yàn)采用基因重組的方式研究堿性蛋白酶基因在大腸桿菌和短小芽孢桿菌中的表達(dá)。試驗(yàn)分為以下6個(gè)部分：
　　 試驗(yàn)一、短小芽孢桿菌NJM4與WHK4生物學(xué)特性的比較研究
　　 系統(tǒng)地比較研究了短小芽孢桿菌-NJM4與WHK4生物學(xué)的差異，分析兩者產(chǎn)蛋白酶差異的原因。首先比較兩者的培養(yǎng)、生理生化特性，

4、然后比較分析了兩者在相同培養(yǎng)基內(nèi)對(duì)產(chǎn)蛋白酶活力及其對(duì)不同底物活力的影響。在基因水平上比較了兩者堿性蛋白酶基因以及該基因上游啟動(dòng)子區(qū)域的基因序列。結(jié)果顯示：兩者生理生化特性無(wú)差異，在培養(yǎng)特性方面則有差異，WHK4的生長(zhǎng)速度較快，在相同的培養(yǎng)基中24 h內(nèi)產(chǎn)生芽孢，而NJM4在相同的時(shí)間內(nèi)未形成芽孢；在產(chǎn)酶方面，WHK4在血紅蛋白和羽毛粉發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)產(chǎn)蛋白酶活力高于NJM4，在營(yíng)養(yǎng)豐富的LB培養(yǎng)基中產(chǎn)蛋白酶活力卻低于NJM4。分別以不同底物

5、測(cè)定的蛋白酶活力WHK4均高于NJM4。在基因水平上兩者堿性蛋白酶基因1152bp的堿基中雖然只有一個(gè)堿基不同，但其對(duì)應(yīng)的密碼子所編碼的氨基酸屬同一個(gè)氨基酸，啟動(dòng)子區(qū)域49bp的基因序列完全相同。試驗(yàn)表明WHK4較NJM4產(chǎn)酶能力強(qiáng)，酶活力高，是產(chǎn)蛋白酶的優(yōu)良菌株。
　　 試驗(yàn)二、短小芽孢桿菌WHK4以羽毛粉為底物產(chǎn)蛋白酶條件的優(yōu)化
　　 探索WHK4以羽毛粉為底物產(chǎn)酶的最佳條件和最佳培養(yǎng)基組成。以羽毛粉發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)

6、，首先采用單因子試驗(yàn)研究底物濃度、初始pH、接種量、外加碳源、外加氮源對(duì)WHK4產(chǎn)酶活力的影響。在單因子試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)底物濃度、溫度、初始pH、接種量、外加(NH4)2SO4、外加麥芽糖進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果顯示：WHK4最佳的產(chǎn)酶條件為初始pH7.38，菌齡16 h，接種量5％，37℃。最佳的培養(yǎng)基組成為：1L基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，40.0 g羽毛粉，10.0 g(NH4)2SO4和10.0 g麥芽糖。在優(yōu)化的條件下WHK424 h

7、產(chǎn)蛋白酶活力為90 U·mL-1。WHK4培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基的優(yōu)化為其產(chǎn)蛋白酶的分離純化奠定了基礎(chǔ)。
　　 試驗(yàn)三、短小芽孢桿菌WHK4蛋白酶的分離、純化及酶學(xué)特性的研究
　　 為得到WHK4酶的純品，更好的了解該酶的酶學(xué)特性，本試驗(yàn)在優(yōu)化的產(chǎn)酶條件下首先制備粗酶液，然后采用50％飽和硫酸銨鹽析，沉淀用1/10體積的PBS溶液溶解后透析除鹽，經(jīng)Sephdex G-100凝膠過(guò)濾層析分離出蛋白酶。對(duì)所得的蛋白酶進(jìn)行SDS-P

8、AGE酶譜分析，測(cè)定酶最適作用溫度和pH，對(duì)酶學(xué)特性進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示：WHK4以羽毛粉為底物發(fā)酵液中含有兩種蛋白酶，其中一種蛋白酶分子量約為50 KD，該酶作用最適溫度為60℃，最適pH為8.5，F(xiàn)e3+、Cu2+、SDS、EDTA對(duì)蛋白酶活力有較強(qiáng)的抑制作用，Ba2+、Ca2+、Mg2+和Fe2+以及有機(jī)溶劑DMSO、異丙醇、甘油，表面活性劑TritonX-100對(duì)蛋白酶活力幾乎無(wú)影響。表明該酶屬于金屬蛋白酶，在耐有機(jī)溶劑生物催化劑

9、方面有潛在的應(yīng)用前景，在洗滌工業(yè)生產(chǎn)中也有較大的應(yīng)用價(jià)值。
　　 試驗(yàn)四、短小芽孢桿菌NJM4堿性蛋白酶基因的表達(dá)與活性分析
　　 為提高堿性蛋白酶的產(chǎn)酶量，本試驗(yàn)研究其在大腸桿菌中的表達(dá)。采用同源克隆的方法設(shè)計(jì)堿性蛋白酶基因擴(kuò)增引物，用高保真DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物和克隆載體pUC57經(jīng)XbaI和BamHI雙酶切后連接構(gòu)建pUC57-AP，轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，涂布LB/Amp/X-gal

10、/IPTG培養(yǎng)基平板，挑選白色菌落進(jìn)行PCR鑒定，然后測(cè)序分析。將PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體pET-28b經(jīng)NcoI和BamHI雙酶切后連接構(gòu)建pET-28b-AP，轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，涂布LB/Kan/酪蛋白培養(yǎng)基平板，挑選有水解圈的陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR鑒定，對(duì)陽(yáng)性克隆用IPTG誘導(dǎo)4 h后測(cè)定發(fā)酵液的蛋白酶活力。結(jié)果表明，克隆得到的NJM4堿性蛋白酶基因全長(zhǎng)為1152 bp，編碼383個(gè)氨基酸，成熟肽276個(gè)氨基酸。從LB/K

11、an/酪蛋白平板培養(yǎng)基篩選有透明水解圈的菌株，命名為BL21(DE3)-28b-AP。該菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后發(fā)酵上清液蛋白酶活力為不含重組子菌株的37.3倍。成功地構(gòu)建具有蛋白酶活力的高效表達(dá)的菌株為堿性蛋白酶的批量生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。
　　 試驗(yàn)五、短小芽孢桿菌NJM4原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化研究
　　 探索短小芽孢桿菌原生質(zhì)體的形成條件及其轉(zhuǎn)化的可行性。采用溶菌酶脫壁制備原生質(zhì)體，進(jìn)行單因子試驗(yàn)，顯微鏡觀察酶的濃度、作用溫度，酶解時(shí)

12、間對(duì)原生質(zhì)體形成率的影響。在最適宜的條件下制備原生質(zhì)體，在Ca2+的環(huán)境中用PEG6000誘導(dǎo)pUC57-AP重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化，采用含氨芐青霉素的DM3培養(yǎng)基平板篩選轉(zhuǎn)化子。結(jié)果顯示，用含氨芐青霉素的DM3培養(yǎng)基平板篩選的轉(zhuǎn)化子經(jīng)含氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后其蛋白酶的活力幾乎喪失。表明短小芽孢桿菌NJM4&于原生質(zhì)體化，可以實(shí)現(xiàn)外源質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，是一株潛在的基因工程受體菌。
　　 試驗(yàn)六、分光光度計(jì)法檢測(cè)原生質(zhì)體形成過(guò)程的初步研究<

13、br>　　 探索芽孢桿菌原生質(zhì)體形成過(guò)程中光密度的變化與原生質(zhì)體形成率之間的關(guān)系。采用分光光度計(jì)測(cè)定原生質(zhì)體形成過(guò)程中溶液的OD60nm，同時(shí)采用鏡檢計(jì)數(shù)測(cè)定原生質(zhì)體形成率，分別繪制光密度變化曲線和原生質(zhì)形成曲線，采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件中CurveEstimation分析兩者之間的相關(guān)性并進(jìn)行曲線擬合。結(jié)果顯示：原生質(zhì)體溶液光密度的變化和原生質(zhì)體的形成率之間存在顯著的相關(guān)性(R2=0.985，P<0.01)，隨著原生質(zhì)體形成率的增加溶液