桔小實(shí)蠅胰蛋白酶酶學(xué)性質(zhì)研究及蛋白酶基因表達(dá)模式分析.pdf

1、本學(xué)位論文基于桔小實(shí)蠅轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選、鑒定出了了桔小實(shí)蠅5個(gè)胰蛋白酶基因（BdTry1、BdTry2、BdTry3、BdTry4和BdTry5）、2個(gè)天冬氨酸酶基因（BdAsp1、BdAsp2）和2個(gè)羧肽酶基因(BdCP1、BdCP2)的全長(zhǎng)cDNA序列，在序列分析的基礎(chǔ)上，利用qPCR技術(shù)重點(diǎn)解析了這些在桔小實(shí)蠅不同發(fā)育階段、取食前后以及受胰蛋白酶抑制劑和高效氯氰菊酯脅迫處理后的應(yīng)激表達(dá)模式，同時(shí)，在蛋白水平對(duì)相關(guān)酶活性進(jìn)行了檢測(cè)。

2、研究結(jié)果將有助于明確桔小實(shí)蠅蛋白酶基因的功能及其調(diào)控機(jī)制，為桔小實(shí)蠅的持續(xù)防控提供新的思路和方法。主要研究結(jié)果如下:
　　1.桔小實(shí)蠅9個(gè)蛋白酶基因的表達(dá)模式分析
　　1.1.桔小實(shí)蠅9個(gè)蛋白酶基因在不同發(fā)育階段的表達(dá)模式分析
　　利用qPCR技術(shù)分析桔小實(shí)蠅9個(gè)蛋白酶基因在幼蟲階段第一、三、五天，蛹和成蟲期的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，這9個(gè)基因的表達(dá)高峰均出現(xiàn)在孵化后3-5 d的幼蟲期，化蛹后表達(dá)量迅速下降并維持在

3、較低水平;羽化后這些蛋白酶基因的表達(dá)量逐漸上升?？傮w來(lái)看，9個(gè)蛋白酶基因的表達(dá)量在幼蟲期最高，成蟲期次之、卵期最低，推測(cè)這些基因的表達(dá)與桔小實(shí)蠅幼蟲、成蟲期的取食行為有密切的關(guān)系。
　　1.2.桔小實(shí)蠅9個(gè)蛋白酶基因在胰蛋白酶抑制劑處理后的表達(dá)模式分析
　　利用qPCR技術(shù)分析在胰蛋白酶抑制劑處理后桔小實(shí)蠅9個(gè)蛋白酶基因在成蟲中腸的表達(dá)情況。結(jié)果表明，經(jīng)抑制劑TLCK(100μg/mL)的處理，9個(gè)蛋白酶基因除ASP1外，均

4、出現(xiàn)了2倍以上的上調(diào)，而同濃度的SBTI對(duì)各基因的影響并不明顯，5個(gè)胰蛋白酶基因中只有Try3和Try4出現(xiàn)了顯著的上調(diào)，而其余4個(gè)基因只有CP2和ASP2基因出現(xiàn)上調(diào)。表明桔小實(shí)蠅受到胰蛋白酶專性抑制劑脅迫時(shí)，體內(nèi)蛋白酶基因的表達(dá)出現(xiàn)了上調(diào)的情況，以此抵御抑制劑對(duì)蟲體的影響。
　　1.3.饑餓及飼喂條件下桔小實(shí)蠅9個(gè)蛋白酶基因的表達(dá)模式分析
　　以桔小實(shí)蠅饑餓24 h后相關(guān)基因的表達(dá)量作為對(duì)照，分析飼喂后，胰蛋白酶基因24

5、 h內(nèi)表達(dá)量的階段性變化，結(jié)果表明，除了Try3外，其他基因均在飼喂6h后出現(xiàn)顯著的上調(diào)，而在12至18h的時(shí)間段出現(xiàn)表達(dá)高峰，隨后在24 h以后出現(xiàn)顯著的回落。此外，羧肽酶基因也在飼喂18h后出現(xiàn)了2倍以上的上調(diào)現(xiàn)象。推測(cè)桔小實(shí)蠅對(duì)食物的消化高峰出現(xiàn)再取食后18h，并且由胰蛋白酶和羧肽酶等共同參與，是一個(gè)多種蛋白酶協(xié)同作用的過程。
　　1.4.高效氯氰菊酯脅迫下桔小實(shí)蠅5個(gè)胰蛋白酶基因表達(dá)模式分析
　　為明確逆境脅迫對(duì)桔小

6、實(shí)蠅蛋白酶影響，對(duì)高效氯氰菊酯脅迫后桔小實(shí)蠅5個(gè)胰蛋白酶基因的表達(dá)模式進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明，5個(gè)胰蛋白酶基因在脅迫后均出現(xiàn)不同程度的上調(diào)，上調(diào)倍數(shù)介于1.5-2.3倍不等。說明桔小實(shí)蠅會(huì)提高體內(nèi)的能量代謝來(lái)抵御逆境的脅迫。
　　2.桔小實(shí)蠅胰蛋白酶活性及總蛋白酶活性的測(cè)定
　　2.1.桔小實(shí)蠅胰蛋白酶活性的測(cè)定
　　以BApNA為底物，測(cè)定桔小實(shí)蠅不同發(fā)育階段以及不同組織的胰蛋白酶活性。結(jié)果表明，在桔小實(shí)蠅幼蟲、蛹和成

7、蟲3個(gè)發(fā)育階段中，幼蟲期的胰蛋白酶活性最高;在幼蟲的3個(gè)組織中（表皮、中腸和脂肪體），中腸胰蛋白酶活性最高。說明桔小實(shí)蠅胰蛋白酶主要在幼蟲的中腸發(fā)揮作用。
　　2.2.高效氯氰菊酯脅迫下桔小實(shí)蠅胰蛋白酶活性測(cè)定
　　以含0.33μg/g高效氯氰菊酯的飼料飼喂桔小實(shí)蠅幼蟲5d后，分別以BApNA和TAME為底物檢測(cè)幼蟲中腸胰蛋白酶的酯水解活性和酰胺水解活性。結(jié)果顯示，在高效氯氰菊酯的脅迫下，幼蟲胰蛋白酶的酯水解活性和酰胺水解活

8、性都顯著升高。說明桔小實(shí)蠅受到藥劑脅迫后體內(nèi)消化酶活性出現(xiàn)了增強(qiáng)。
　　2.3.蛋白抑制劑處理后桔小實(shí)蠅胰蛋白酶及總蛋白酶活性測(cè)定
　　以含100μg/mL胰蛋白酶專性抑制劑TLCK和SBTI的飼料飼喂剛羽化的成蟲5d，測(cè)定成蟲中腸的胰蛋白酶及總蛋白酶活性。結(jié)果顯示，抑制劑處理后成蟲中腸的胰蛋白酶酶活被顯著抑制，且抑制率達(dá)到70％。但是，總蛋白酶活性卻保持恒定。說明桔小實(shí)蠅在受到胰蛋白酶抑制劑脅迫時(shí)，通過其它蛋白酶活性的提高