南極磷蝦胰蛋白酶表達載體構建與高效表達.pdf

1、南極磷蝦屬節(jié)肢動物門甲殼綱磷蝦目，這種無脊椎動物是南極海域的關鍵物種，主要圍繞極地分布并集中于南冰洋，為多細胞生物中生物質(zhì)能最大、適應環(huán)境最成功的動物物種之一。
　　特殊寒冷的生活環(huán)境造就了南極磷蝦體內(nèi)很多活性物質(zhì)都具有較高的研究價值，其中以胰蛋白酶的低溫高效性較為突出。南極磷蝦胰蛋白酶已經(jīng)在清除機體壞死組織、治療角膜堿燒傷以及清除牙斑等醫(yī)學領域得到了廣泛的應用，并且成為輕工業(yè)、食品、醫(yī)藥等學科的研究熱點。
　　由于磷蝦樣品

2、提取胰蛋白酶的現(xiàn)實困難和相對高昂的成本，本實驗采用基因工程技術將南極磷蝦胰蛋白酶基因轉(zhuǎn)入工程菌中，利用基因工程技術表達目的蛋白并初步純化，為南極磷蝦胰蛋白酶的研究提供更加深入的資料和依據(jù)。
　　研究內(nèi)容:
　　(1)以南極磷蝦mRNA為模板，通過分析南極磷蝦胰蛋白酶基因，設計基因特異性引物，逆轉(zhuǎn)錄得到南極磷蝦胰蛋白酶cDNA。
　　(2)構建pGEX-2T-TRY（TRY代表南極磷蝦胰蛋白酶）原核表達載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細

3、胞，并經(jīng)PCR、雙酶切及測序進行鑒定。
　　(3)將pGEX-2T-TRY轉(zhuǎn)化入工程菌E.coli BL21，優(yōu)化表達條件，以實現(xiàn)目的蛋白的表達。
　　(4)工程菌經(jīng)超聲裂解，獲得目的蛋白。檢測目的蛋白的酶解活性并對目的蛋白初步純化。
　　研究結(jié)果:
　　(1)利用TAIL-PCR技術獲得基因序列，經(jīng)分析比對確認為南極磷蝦胰蛋白酶基因，設計基因特異性引物，以南極磷蝦RNA為模板成功逆轉(zhuǎn)錄出cDNA。
　　(

4、2)構建的pGEX-2T-TRY原核表達載體，經(jīng)PCR和雙酶切以及測序鑒定證明已構建成功。
　　(3)工程菌E.coli BL21經(jīng)IPTG誘導后，成功表達出融合蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)在55KDa處有明顯的目的蛋白條帶，與預期的結(jié)果一致。
　　(4)選用谷胱甘肽瓊脂糖凝膠來純化帶有GST標簽的融合蛋白，初步純化出目的蛋白，但是尚未發(fā)現(xiàn)該蛋白具有酶活性。
　　研究結(jié)論]
　　本實驗成功構建了原核