重組人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑在甲醇酵母中的高效表達(dá).pdf

1、　 本研究根據(jù)人源性胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑(HuPSTI)的氨基酸序列，選用畢赤酵母偏好密碼子人工設(shè)計(jì)合成了HuPSTI的全基因序列，克隆到畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K中，構(gòu)建了分泌型表達(dá)載體pPIC9K-PSTI，用SacI線性化載體，采用電激法轉(zhuǎn)化畢赤酵母KM71，得到的His菌株再用G418篩選抗性克隆，然后進(jìn)行搖瓶表達(dá)，探討了在不同pH條件下進(jìn)行誘導(dǎo)以及不同甲醇濃度對(duì)HuPSTI表達(dá)量的影響?！　¤b于適合高密度發(fā)酵表達(dá)的特

2、點(diǎn)，本研究還對(duì)重組表達(dá)菌株KM71(pPIC9K-PSTI)進(jìn)行發(fā)酵工藝摸索，研究了發(fā)酵pH值，誘導(dǎo)碳源和誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)HuPSTI的表達(dá)量的影響。結(jié)果表明，當(dāng)培養(yǎng)基pH為6.0時(shí)，誘導(dǎo)碳源為甲醇+甘油時(shí)，可獲得高表達(dá)量的HuPSTI蛋白。發(fā)酵上清經(jīng)采用陰離子交換層析(QSepharoseXL)和分子篩層析(SepherdexG50)可純化出HuPSTI目的蛋白，100ml發(fā)酵上清可獲得90mg電泳純的HuPSTI，比目前所知的重組HuPS

3、TI的最高表達(dá)量提高了18倍。蛋白N端測序結(jié)果表明本研究獲得的重組HuPSTI具有兩種結(jié)果：一種是與原蛋白序列一樣(rHuPSTI)，另一種是在N端多出兩個(gè)氨基酸EA(rHuPSTI，)。雖然兩種蛋白有兩個(gè)氨基酸的差別但它們的活性幾乎完全相同。本研究還對(duì)重組HuPSTI的性質(zhì)進(jìn)行了分析，酶活測定表明純化的1mgHuPSTI可以抑制3.4-3.8mg牛胰蛋白酶(Trypsinfrombovinepancreas，6630U/mg，Sigm