播娘蒿胰蛋白酶抑制劑基因轉(zhuǎn)化油菜的研究.pdf

1、植物蛋白酶抑制劑基因具有廣譜抗蟲(chóng)性、安全,無(wú)毒副作用等優(yōu)點(diǎn),研究蛋白酶抑制劑基因具有重要意義。本研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將2個(gè)播娘蒿胰蛋白酶抑制劑(DSTI)基因?qū)敫仕{(lán)型油菜中,研究其功能,主要結(jié)果如下： 構(gòu)建植物表達(dá)載體pCAMBI1301-DsTI1和pCAMBI1301-DsTI2,經(jīng)酶切驗(yàn)證后,轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株LBA4404中。建立了甘藍(lán)型油菜品系NJ5424子葉節(jié)的遺傳轉(zhuǎn)化體系,將油菜子葉節(jié)在附加4mg/L 6-BA的培養(yǎng)

2、上進(jìn)行預(yù)培養(yǎng),在含有3.0mg/L 6-BA、0.1mg/LNAA和12.5mg/L潮霉素(Hyg)的選擇培養(yǎng)中篩選。再生芽在含有2.0mg/L 6-BA、0.1mg/L NAA和12.5mg/L Hyg的培養(yǎng)基中進(jìn)行分化培養(yǎng)。DsTI1和DsTI2轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜品系NJ5424共獲得41株潮霉素抗性植株,經(jīng)過(guò)PCR鑒定共計(jì)獲得17株陽(yáng)性植株。 對(duì)2個(gè)基因的T1代轉(zhuǎn)基因油菜進(jìn)行PCR檢測(cè),結(jié)果表明T1代轉(zhuǎn)基因油菜植株呈現(xiàn)3:1分

3、離,表明目的基因以單拷貝插入油菜基因組中,并且能夠在轉(zhuǎn)基因油菜后代中穩(wěn)定遺傳。RT-PCR實(shí)驗(yàn)表明外源基因DsTI1、DsTI2在轉(zhuǎn)基因油菜中可正常表達(dá)。酶活性測(cè)定結(jié)果表明,DsTI1和DsTI2轉(zhuǎn)基因油菜對(duì)胰蛋白酶和糜蛋白酶的抑制能力遠(yuǎn)高于野生型,說(shuō)明播娘蒿胰蛋白酶抑制劑基因具有絲氨酸蛋白酶抑制劑功能。 室內(nèi)抗蟲(chóng)性實(shí)驗(yàn)表明,喂食轉(zhuǎn)基因油菜葉片的菜青蟲(chóng)幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育緩慢,死亡率升高；轉(zhuǎn)基因油菜具有抗蟲(chóng)性。田間蟲(chóng)害調(diào)查結(jié)果顯示蟲(chóng)害