辣椒快速繁殖體系的建立及豇豆胰蛋白酶抑制劑基因轉化的研究.pdf

1、遼寧師范大學碩士學位論文辣椒快速繁殖體系的建立及豇豆胰蛋白酶抑制劑基因轉化的研究姓名：王朋申請學位級別：碩士專業(yè)：植物學指導教師：王關林20000601辣椒快速繁殖體系的建立及豇豆胰蛋白酶抑制劑基固轉化的研究1 抗蟲植物基因工程進展1 ．1 植物基因工程概述植物基因工程是近年來隨著D N A 重組技術、植物組織培養(yǎng)及遺傳轉化技術、外源基因表達的檢測技術的發(fā)展而迅速興起的新學科。采用工程設計的方式，通過D N A 體外重組技術將特定的外源

2、D N A 導入受體細胞中，由此獲得的轉化植株可表現(xiàn)出預期的遺傳特性。白七十年代末根癌農桿菌T i 質粒介導的植物轉化系統(tǒng)建立以來，外源基因轉化技術不斷完善。目前，已有2 0 0 多種轉基因植物問世．其中包括大豆、胡蘿h 、番茄、馬鈴薯、小麥、玉米、水稻等。植物基因工程已逐漸走向應用階段，批準進入田間實驗的轉基因植物超過5 0 0 例( 賈士榮．1 9 9 4 ) 。植物基因工程不但在植物的抗病、抗蟲、抗除草劑、抗逆境方面取得了重要進展

3、，在培育作物的高產優(yōu)質、延長果蔬貯存時間、培育雄性不育材料方面取得了重要突破。M o n s a n t o 公司轉蘇云桿菌毒蛋白( B t t o x i n )基因的棉花經(jīng)數(shù)年田間實驗，表現(xiàn)出顯著的抗棉鈴蟲和紅鈴蟲能力。植物基因工程涉及以下幾個重要的技術環(huán)節(jié)：( 1 ) 目的基因的分離鑒定和修飾；( 2 ) 植物表達載體的構建；( 3 ) 植物受體的遺傳轉化；( 4 ) 轉化細胞和植株的篩選及鑒定，這些環(huán)節(jié)都已取得重大突破，推動了植

4、物基因工程的發(fā)展。進行植物基因工程操作，其前提是獲得目的基因。至今已分離的供植物基因工程使用的基因有幾百個，包括抗病基因、抗蟲基因、抗除草劑基因，以及提高植物體中蛋白質含量或品質的基因等。目的基因導入植物細胞需借助植物表達載體。構建植物表達載體就是在目的基因的5 一’端加上啟動子，在3 一’端加上終止子．以使外源基因能在植物細胞內有效地表達。外植體經(jīng)轉化后，只有極少數(shù)細胞中導入了外源D N A ，因此需淘汰非轉化細胞。目前常在表達載體中

5、加入篩選標記基因( 如抗菌素抗性基因和抗除草劑基因) 以利于后期的篩選；為了快速簡易區(qū)分轉化體還常用到報告基因( R e p o r t e r g e n e ) ，其中以葡聚糖醛酸苷酶( B —G 1 U C F O r l a S e ，G U S ) 基因應用居多。目的基因引入過程是基因工程操作的重要一環(huán)，植物的遺傳轉化是指利用生物及物理化學手段將外源基因導入植物細胞的技術。迄今已建立1 1 種基因轉化方法，按轉化原理可分為種質

6、轉化系統(tǒng)，直接轉化系統(tǒng)和載體轉化系統(tǒng)( 王關林，1 9 9 8 ) 。其中農桿菌質粒轉化系統(tǒng)最為成熟，獲得成功的例子最多。轉化的外植體采用質粒D N A 篩選標記基因編碼的抗生素或除草劑等進行篩選，淘汰掉非轉化細胞，然后利用植物細胞全能性使轉化細胞再生成完整植株。由于轉化細胞與非轉化細胞間的物質交流會產生交叉保護現(xiàn)象，也有少數(shù)非轉化細胞在篩選過程中得以生長并產生假陽性植株，因而對經(jīng)篩選的植株仍需進一步進行分子鑒定?？捎肞 C R 和S

7、o u t h e r nb l o t 法鑒定目的基因的整合；通過N o r t h e r nb l o t 確定外源D N E 的整合與轉錄；利用w e s t e r nb l o t 和E L I S E 技術驗證外源D N A 在宿主細胞內的翻譯表達。利用上述各種手段，植物基因工程取得了很大發(fā)展，給農作物育種提供了一條非常有效的途徑，其中阻抗蟲植物基因工程獲得的成效晟為顯著。1 ．2 抗蟲植物基因工程農作物蟲害給農業(yè)生產帶來