白念珠菌天冬氨酸蛋白酶2真核表達(dá)載體的構(gòu)建及原核表達(dá).pdf

1、研究背景：
　　 白念珠菌(Candida albicans，C.albicans)是人類最常見的條件致病性真菌(opportunistic pathogen fungi)，可引起機體淺部和深部的廣泛損害，尤其是侵襲性念珠菌病，診斷困難，治療也比較棘手，而基因疫苗在預(yù)防和治療該類疾病方面有其獨特的優(yōu)勢。然而，由于我們對白念珠菌的致病機制及宿主的免疫應(yīng)答的認(rèn)識有限，其疫苗的研制也因此受到限制。本課題主要構(gòu)建了白念珠菌毒性因子之一的

2、天冬氨酸蛋白酶2適用于原核表達(dá)系統(tǒng)和真核表達(dá)系統(tǒng)的重組質(zhì)粒，并且在原核系統(tǒng)中表達(dá)并純化出可溶的目的蛋白；為下一步進(jìn)行動物免疫及鑒定試驗，進(jìn)而研究天冬氨酸蛋白酶的致病性及免疫機制奠定基礎(chǔ)，同時為未來白念珠菌基因疫苗的實施應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)。
　　 目的：
　　 構(gòu)建白念珠菌pCDNA3.1/SAP2表達(dá)載體作為基因疫苗；構(gòu)建Sap2重組原核表達(dá)載體并表達(dá)、純化出可溶性的蛋白作為抗原，用于檢測接種疫苗后小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的抗體。

3、r>　　 方法：
　　 從白念珠菌中提取基因組DNA為模板，用PCR方法獲取SAP2基因。將真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)myc-HisC、原核表達(dá)載體pET32a(+)、pMAL-c2x(+)分別與SAP2基因行雙酶切，瓊脂糖凝膠純化，連接酶切產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)菌，篩選菌落和測序鑒定。用無內(nèi)毒素的質(zhì)粒大提試劑盒提取重組真核表達(dá)質(zhì)粒。將重組原核表達(dá)載體pET32a/SAP2、pMAL-c2x/SAP2轉(zhuǎn)化

4、大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，在16℃經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)出可溶性的融合蛋白。其中pMAL-c2x/SAP2的基因工程菌表達(dá)出的融合蛋白經(jīng)淀粉樹脂親和層析純化，并用蛋白酶Factor Xa(NEB)切割標(biāo)簽，得到Sap2蛋白。
　　 結(jié)果：
　　 1.經(jīng)PCR擴增獲得的目的基因分子量與預(yù)計相同，并定向插入真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)myc-HisC中，雙酶切后電泳獲得預(yù)期的SAP2條帶，測序證實為正確的SAP

5、2序列。
　　 2.SAP2基因定向插入原核表達(dá)載體pET32a(+)、pMAL-c2x(+)中，測序證實為正確的SAP2序列，閱讀框架正確，可以進(jìn)行目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。
　　 3.重組原核表達(dá)載體pET32a/SAP2、pMAL-c2x/SAP2的基因工程菌在16℃經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后均表達(dá)出可溶性的融合蛋白，其中后者表達(dá)的融合蛋白經(jīng)純化、切除標(biāo)簽后得到目的蛋白。
　　 結(jié)論：
　　 1.成功構(gòu)建了pcDN