hTERT真核表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá).pdf

1、背景與目的：端粒酶是一種以自身的RNA組分為模板，逆轉(zhuǎn)錄合成端粒末端串聯(lián)重復(fù)序列的核糖核蛋白。端粒酶的表達(dá)水平與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后有著高度相關(guān)性。人端粒酶有三個重要組成部分，即端粒酶RNA組分(HumanTelomeraseRNA,hTR)，在端粒DNA合成中充當(dāng)模板的作用；蛋白質(zhì)亞單位，即端粒酶相關(guān)蛋白(HumanTelomeraseAssociatedProteinI,hTEPI)；催化亞單位，即端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTE

2、RT)，被認(rèn)為是端粒酶活性的限制性因素。研究顯示，80％～90％的人惡性腫瘤組織端粒酶活性陽性，并且與hTERTmRNA活性相一致，表明hTERT基因表達(dá)對腫瘤組織端粒酶活性起決定性作用。而除干細(xì)胞、激活的淋巴細(xì)胞和生殖細(xì)胞外絕大多數(shù)組織細(xì)胞沒有端粒酶活性。端粒酶活性的重建是腫瘤多步發(fā)生的重要分子事件，同時也是腫瘤治療的重要靶點。近年有關(guān)hTERT在腫瘤免疫和治療中的研究已成熱點。為探討hTERT作為腫瘤疫苗的可行性，作者將hTERT部

3、分基因片段克隆入真核表達(dá)載體pEGFP-C3中，進(jìn)行了篩選和鑒定，并進(jìn)一步將其轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞NIH3T3，觀察轉(zhuǎn)染效果，為進(jìn)一步研究基于hTERT的疫苗奠定基礎(chǔ)。 方法：用RT-PCR方法從肝癌組織中提取總RNA擴增出hTERT基因片段，將其連接在pGEM-TEasy質(zhì)粒上，轉(zhuǎn)化JM109，用pGEM-T質(zhì)粒上T7/SP6序列設(shè)計出的引物對連接的正確性進(jìn)行鑒定，利用Amp抗性對陽性進(jìn)行篩選，并進(jìn)行DNA測序，以保證克隆的目的片段的

4、正確性。將重組質(zhì)粒pGEM-T-hTERT和pEGFP-C3真核綠色熒光蛋白表達(dá)載體，同時用HindⅢ和BamHⅠ雙酶切，電泳純化后進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化細(xì)菌TG1，再次篩選鑒定出陽性克隆，進(jìn)行DNA測序。將重組的pEGFP-C3-hTERT提取純化后經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染小鼠成纖維細(xì)胞系NIH3T3，經(jīng)G418篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系，熒光倒置顯微鏡觀察。用RT-PCR方法檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞的hTERTmRNA表達(dá)水平。 結(jié)果：1.靶基因擴增：R

5、T-PCR方法從肝癌組織中提取總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,擴增hTERT基因片段(1590-2550nt)，共961bp。 2.靶基因與pGEM-T連接后，以引物T7/SP6對轉(zhuǎn)化后的質(zhì)粒進(jìn)行擴增，篩選得到1137bp的陽性克隆重組子(pGEM-T-hTERT)。 3.靶基因與pEGFP-C3連接后，以自身引物對轉(zhuǎn)化后的質(zhì)粒進(jìn)行擴增，得到961bp的陽性克隆重組子(pEGFP-C3-hTERT)。 4.DNA序列分

6、析證實了重組載體pGEM-T-hTERT和pEGFP-C3-hTERT內(nèi)插入片段的堿基組成與公開發(fā)表的hTERT序列一致，證實陽性克隆插入片段為目的基因hTERT。 5.轉(zhuǎn)染pEGFP-C3-hTERT的NIH3T3細(xì)胞可見綠色熒光，細(xì)胞核和胞膜均有熒光出現(xiàn)，說明轉(zhuǎn)染成功。 6.轉(zhuǎn)染pEGFP-C3-hTERT的NIH3T3細(xì)胞中有較高水平的人hTERTmRNA表達(dá)，而未轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒NIH3T3細(xì)胞中則無人的hTER