siRNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建及對MSTN基因表達(dá)抑制的研究.pdf

1、肌生成抑制素基因(myostatin，MSTN)是肌肉生長的負(fù)調(diào)控因子，其變異或缺失會導(dǎo)致肌細(xì)胞增生與肌纖維肥大。RNA干擾(RNAi)是一種特異性降解靶基因mRNA序列的基因表達(dá)調(diào)節(jié)機制，具有高效、特異、快速等優(yōu)點，已成為研究基因功能和表達(dá)調(diào)控的有效方法。 目前通過合成siRNA來抑制MSTN基因表達(dá)或阻斷與該基因功能相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，已獲得了雙肌表現(xiàn)型的斑馬魚、大鼠及小鼠等，而利用該方法對綿羊MSTN基因的研究國內(nèi)外還未見

2、相關(guān)的報道。 本實驗?zāi)康脑谟诤Y選有效抑制綿羊myostatin基因的siRNA分子，以小鼠為模型研究siRNA對MSTN基因的抑制作用。通過設(shè)計8對針對綿羊MSTN mRNA序列siRNA單鏈引物，經(jīng)過退火形成雙鏈siRNA模板插入pSilencer(TM)4.1-CMV neo載體，連接構(gòu)建成Psi-mstn-siRNA載體，轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞后，利用RT-PCR及real time-PCR檢測干擾效果，篩選有效的siRNA分

3、子。結(jié)果表明所構(gòu)建的8條siRNA分子中有3條對MSTN基因有顯著抑制作用，其中psi-mstn-717和psi-mstn-986分子對MSTN mRNA抑制效率分別達(dá)到61％和53％。接著我們嘗試著檢驗這兩條siRNA分子在動物活體中的干擾作用。采用直接注射配合電擊融合法將有活性的siRNA分子導(dǎo)入小鼠腓腸肌，兩周后處死動物，采用realtimePCR及免疫組化法檢測干擾分子對MSTN基因的抑制作用，利用組織切片、圖像分析軟件檢測肌纖