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文檔簡介
1、目的:
構建靶向小鼠鞘氨醇激酶-1(sphingosine kinase-1,SPK1)基因的RNA干擾(R NA interference,RNAi)載體并轉染小鼠Lewis肺癌(Lewis lung cancer,LLC)細胞,觀察其轉染效果,為進一步探索SPK1與非小細胞肺癌之間的關系提供一種技術手段。
方法:
選取文獻已證實有效的、針對小鼠SPK1基因的特異性小干擾RNA(small interfe
2、ring RNA,siRNA)序列,根據上述序列人工合成模版序列,然后將其和雙酶(AgeI和EcoRI)切后的線性質粒載體連接,將連接后的產物轉化到感受態(tài)細菌中,對在含抗生素的培養(yǎng)皿中長出的菌落進行PCR擴增,然后對其進行電泳及測序分析。通過轉基因技術利用脂質體將其導入小鼠Lewis肺癌細胞中,熒光顯微鏡下觀察綠色熒光、流式細胞儀檢測其轉染效率,免疫印跡檢測SPK1蛋白的表達。
結果:
經酶切、測序驗證,小鼠SPK1
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