人BRMS1基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定.pdf

1、目的: 利用人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7提取總RNA，經(jīng)RT-PCR反應(yīng)得到乳腺癌轉(zhuǎn)移抑制基因BRMS 1的CDS(Coding Sequence)，通過(guò)雙酶切及連接反應(yīng)將其連接到質(zhì)粒pcDNA3.1/myc-his(-)B上，構(gòu)建BRMS 1基因的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-)B/myc-BRMS 1并鑒定，為進(jìn)一步研究惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移機(jī)制及腫瘤轉(zhuǎn)移的基因治療奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。 方法: 常規(guī)方法培養(yǎng)人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7，TRIZ

2、OL法提取細(xì)胞株總 RNA；設(shè)計(jì)含有Xho Ⅰ和HindⅢ酶切位點(diǎn)的一對(duì)引物(上游引物含XhoⅠ酶切位點(diǎn)，下游引物含HindⅢ酶切位點(diǎn))，經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得BRMS1 cDNA的CDS序列，再以cDNA的CDS序列為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，經(jīng)回收、純化、酶切后，連接到質(zhì)粒pcDNA3.1/myc-His(-)B上，構(gòu)建乳腺癌轉(zhuǎn)移抑制基因的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-)B/myc-BRMS 1，限制性內(nèi)切酶酶切分析及基因測(cè)序鑒定正確后

3、轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞HEK-293，行Western blot驗(yàn)證其是否表達(dá)。 結(jié)果: 重組質(zhì)粒pcDNA3.1(-)B/myc-BRMS 1經(jīng)Xho Ⅰ和HindⅢ雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳顯示5.46Kb和744bp兩個(gè)片斷，5.46Kb的片斷符合pcDNA3.1/myc-His(-)B酶切后的大小，744bp符合RT-PCR反應(yīng)擴(kuò)增后產(chǎn)生的BRMS 1基因片斷酶切后的大小。人BRMS 1全長(zhǎng)1485bp，其中CDS區(qū)域?yàn)?122bp

4、-862 bp，741bp)，而擴(kuò)增產(chǎn)生的BRMS 1 cDNA的基因片斷為756bp，包含CDS序列。重組真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-)B/myc-BRMS 1經(jīng)Xho Ⅰ和HindⅢ雙酶切后，進(jìn)一步將重組體進(jìn)行基因測(cè)序分析，驗(yàn)證了克隆的人BRMS 1基因cDNA序列與GenBank[AF159141]公布的人BRMS 1基因的cDNA序列吻合，這一結(jié)果表明重組體pcDNA3.1(-)B/myc-BRMS 1中插入的目的基因BRM