人同源盒基因HOXB4真核表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定.pdf

1、目的：本實(shí)驗(yàn)旨在從人臍血單個(gè)核細(xì)胞中擴(kuò)增出HOXB4基因，并構(gòu)建出人同源盒基因HOXB4的真核表達(dá)載體，為進(jìn)一步探討HOXB4基因?qū)υ煅杉?xì)胞的增殖及自我更新的影響，并將其應(yīng)用HOXB4擴(kuò)增臍血干細(xì)胞中去，能為造血干細(xì)胞移植提供有效地干細(xì)胞來源。
　　 方法：應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)從人臍血干細(xì)胞中擴(kuò)增出目的基因HOXB4編碼序列的cDNA，并將HOXB4的PCR產(chǎn)物用EcoRI和BamHI雙酶切后連接到用EcoRI和BamHI

2、雙酶切的帶有EGFP編碼序列和內(nèi)部核糖體轉(zhuǎn)入位點(diǎn)(IRES)的真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP中，然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，再進(jìn)行篩選擴(kuò)增，并將篩選的重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切及測(cè)序鑒定，并轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)一步鑒定載體可否應(yīng)用。
　　 結(jié)果：成功從人臍血單個(gè)核細(xì)胞中克隆出HOXB4基因，并將其連接到目的載體pIRES2-EGFP中，雙酶切和質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果證實(shí)連接正確，且基因的開放閱讀框架正確，pIRES2-EGFP/HOXB4真核表達(dá)載