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1、目的:本實(shí)驗(yàn)旨在構(gòu)建人同源盒基因(HomeoboxGene)HOXB4的慢病毒載體,探討慢病毒介導(dǎo)的HOXB4感染人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞后的變化。
方法:利用PCR擴(kuò)增獲得HOXB4,并克隆入慢病毒穿梭載體Lend-shuttle。運(yùn)用四質(zhì)粒慢病毒包裝系統(tǒng)轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,48h收獲侵病毒Lend-HOXB4,并測(cè)定慢病毒滴度。將Lend-HOXB4感染人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞,倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞感染效果,確定最佳的病毒感
2、染復(fù)數(shù)(MOI)。同時(shí),利用RT-PCR、免疫熒光染色、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HOXB4的表達(dá)情況,CCK-8檢測(cè)HOXB4對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。
結(jié)果:利用四質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T,成功獲得Lenti-HOXB4,測(cè)定的病毒滴度為3×10。TU/ml;當(dāng)MOI為20時(shí),Lend-HOXB4對(duì)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞具有較高的轉(zhuǎn)染效率,達(dá)80%以上。感染Lend-HOXB4的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞,在mRNA、蛋白水平上均檢測(cè)到了目的基因的表達(dá),其
3、能促進(jìn)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞增殖一倍,流式結(jié)果表:CD340.79%CD451.48%CD10592.68%CD4497.41%與轉(zhuǎn)染前比較CD340.13%CD450.14%.CD10599.95%CD9099.88%,造血細(xì)胞表面標(biāo)志略有增高,間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)志無(wú)明顯改變。
結(jié)論:1.成功構(gòu)建了HOXB4慢病毒載體并獲得了HUCMSCs-HOXB4基因工程細(xì)胞。2.HOXB4基因能促進(jìn)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖.3-HOXB
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