大鼠EPO真核表達載體的構(gòu)建及其在骨髓間充質(zhì)干細胞中的表達.pdf

1、目的：
　　 克隆大鼠腎臟促紅細胞生成素(erythropoietin,EPO)基因片段,構(gòu)建表達大鼠EPO的體外真核表達質(zhì)粒pEGFP-N1/EPO;分離、培養(yǎng)并鑒定大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs),將重組的表達質(zhì)粒pEGFP-N1/EPO轉(zhuǎn)染培養(yǎng)鑒定的大鼠MSCs,并檢測其在體外大鼠MSCs中的表達,為聯(lián)合EPO和MSCs治療缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic en

2、cephalopathy,HIE)引起的腦損傷提供實驗基礎。
　　 方法
　　 1.pEGFP-N1/EPO真核表達載體的構(gòu)建及鑒定:
　　 在無菌、無RNA酶污染的條件下利用寶生物RNAiso Reagent試劑提取出大鼠腎臟組織總RNA。利用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)擴增出大鼠EPO基因cDNA片段,電泳分析結(jié)束后切膠回收純化PCR產(chǎn)物,行上“A”處理并精制,回收產(chǎn)物使用TaKaRa DNA Liga

3、tion Kit與pMD19-T Simple Vector連接后,轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌JM109中,涂布LB瓊脂平板,37℃過夜培養(yǎng)。挑選陽性菌落植菌,提取質(zhì)粒并命名為CTB865-T-1、CTB865-T-2送大連寶生物公司測序,測序結(jié)果使用BLAST軟件與GeneBank數(shù)據(jù)庫進行同源性分析。測序結(jié)果表明,CTB865-T-2質(zhì)粒符合預期要求。然后將CTB865-T-2質(zhì)粒與pEGFP-N1進行雙酶切,使用TaKaRa DNA L

4、igationKit中的連接酶,將CTB865-T-2中插入的目的片段與pEGFP-N1 Vector連接后,熱轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌JM109中,涂布LB瓊脂平板,37℃過夜培養(yǎng)。挑選陽性菌落植菌,提取質(zhì)粒并命名為CTB866-P-1。使用HindⅢ/KpnⅠ對CTB866-P-1質(zhì)粒進行雙酶切電泳鑒定,并送上海生工行插入序列測序。
　　 2.分離、培養(yǎng)、鑒定大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,M

5、SCs)
　　 無菌條件下取出SD大鼠完整的股骨、脛骨并除去所附的軟組織,Percoll液密度梯度法分離大鼠MSCs原代細胞,DMEM/F12培養(yǎng)基加入10％標準胎牛血清培養(yǎng)大鼠MSCs細胞,待細胞融合約80％時,用0.25％胰酶消化傳代培養(yǎng)行貼壁篩選,流式細胞儀鑒定培養(yǎng)至第五代大鼠MSCs細胞表面CD44、CD45、CD90的表達。
　　 3.重組表達質(zhì)粒pEGFP-N1/EPO轉(zhuǎn)染大鼠MSCs并檢測EPO蛋白表達

6、r>　　 將測序結(jié)果正確的CTB866-P-1質(zhì)粒,熱轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌JM109中,涂布LB瓊脂平板,37℃過夜培養(yǎng)。挑選陽性菌落植菌,提取去內(nèi)毒素重組質(zhì)粒pEGFP-N1/EPO,測定其濃度,然后在LipofectamineTM2000的作用下轉(zhuǎn)染大鼠MSCs細胞,轉(zhuǎn)染后約48h-72h觀察MSCs綠色熒光表達,行免疫組化和RT-PCR鑒定EPO蛋白在大鼠MSCs細胞中的表達情況。
　　 結(jié)果
　　 1.反轉(zhuǎn)錄聚

7、合酶鏈反應成功獲得大鼠EPO cDNA,TA克隆法經(jīng)中間T質(zhì)粒構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pEGFP-N1/EPO,酶切和測序鑒定證實本實驗構(gòu)建的重組表達質(zhì)粒正確。
　　 2.流式細胞術(shù)鑒定分離培養(yǎng)的大鼠細胞表達CD44、CD90,不表達CD45,與文獻報道相符,提示成功分離培養(yǎng)大鼠MSCs。
　　 3.重組質(zhì)粒pEGFP-N1/EPO在LipofectamineTM2000下轉(zhuǎn)染大鼠MSCs48h后,免疫組化檢測到大鼠MSCs細胞