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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:(1)克隆酵母菌胞嘧啶脫氨酶(yeast cytosinedeaminase，YCD)基因FCY1片段，構(gòu)建pcDNA3.1-FCY1真核表達(dá)載體。(2)檢測(cè)其在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Human Bone marrow-derivedmesenchymal stem cells，BMSCs)的表達(dá)。
方法:(1)從釀酒酵母菌基因組DNA中克隆FCY1基因CDS區(qū)全序列，構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1/myc-His A+
2、-FCY1。(2)通過用PCR擴(kuò)增、酶切電泳分析及DNA測(cè)序的方法對(duì)重組DNA進(jìn)行鑒定。(3) Percoll密度梯度離心法從人骨髓中分離BMSCs，貼壁培養(yǎng)，從形態(tài)學(xué)特征、流式分析細(xì)胞免疫表型、特異性基因表達(dá)對(duì)BMSCs進(jìn)行鑒定。(4)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染BMSCs并通過RT-PCR檢測(cè)其在BMSCs中的表達(dá)。
結(jié)果:(1)經(jīng)PCR擴(kuò)增、酶切電泳分析和DNA測(cè)序證實(shí)，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的重組質(zhì)粒目的基因片段為YCD基因FCY1-cDNA。
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