酵母菌胞嘧啶脫氨酶對小鼠T淋巴細胞殺傷作用的研究.pdf

1、研究目的:以逆轉錄病毒pMSCV為載體,將釀酒酵母菌來源的胞嘧啶脫氨酶(YCD)基因導入小鼠脾臟來源T淋巴細胞,以此為基礎建立體外實驗平臺,分析前體藥物5-氟胞嘧啶(5-FC)對YCD+T細胞的殺傷效率,即5-FC的適宜劑量和最佳作用時間；觀察靶細胞殺傷過程中產生的旁觀者效應；了解感染過程對T細胞表面抗原表達的影響；建立單純T淋巴細胞植入誘導的完全不相合小鼠GVHD模型,綜合評價YCD/5-FC自殺基因系統在移植中的應用價值,即其防治G

2、VHD的前景。 第一部分逆轉錄病毒載體pMSCV-YCD-GFP的構建 方法: 1.質粒pIRES-YCD擴增、鑒定。 2.將YCD基因插入逆轉錄病毒空載體pMSCV-IRES-GFP。3連接產物做酶切及測序鑒定。 結果: 1.瓊脂糖凝膠電泳顯示,質粒pIRES-YCD的PCR條帶在500bp左右,提示擴增產物為YCD。 2.連接產物經Xho I/Not I酶切后電泳釋放-500b

3、p左右條帶,測序結果"pMSCV-YCD-GFP內僅存在一個突變堿基,且為無意突變,不影響氨基酸表達”,提示病毒載體pMSCV-YCD-GFP構建成功。 第二部分 YCD+T淋巴細胞體外功能研究 方法: 1 逆轉錄病毒pMSCV-YCD-GFP轉染小鼠T淋巴細胞。 2.做YCD+T細胞的蛋白印跡分析。 3.將純化的YCD+T細胞接種于96孔板,分別加入0～100μmol/L 5-FC,CCK-8法

4、測不同劑量、時間點5-FC對靶細胞的殺傷情況。 4.以混合培養(yǎng)和transwell法分別觀察YCD+T細胞凋亡時產生的旁觀者效應。 5.將體外培養(yǎng)6天的基因修飾細胞和單純活化T細胞做CD4、CD8、CD25、CD44等流式檢測。 結果: 1.小鼠T淋巴細胞體外經CD3/CD28活化后可高效轉染YCD基因,感染效率達30％～40％,經熒光篩選后獲得約90％的高純度GFP+T細胞。 2.從蛋白水平驗證

5、了pMSCV-YCD-GFP可以成功感染小鼠T細胞,使其分泌YCD蛋白。 3.小鼠T淋巴細胞表達的YCD可促使5-FC轉化為細胞毒性產物,100μmol/L 5-FC可殺傷超過90％的YCD+T細胞,作用48小時后即可出現細胞凋亡高峰。 4.轉基因細胞與活化T細胞混合培養(yǎng)時,旁觀者效應存在劑量依賴性,即隨著YCD+T細胞的增多,旁觀者效應逐漸增強,而transwell中各效靶比均未觀察到旁觀者效應。 5.YCD+

6、T細胞與空轉細胞GFP-T在主要抗原表達上無明顯差異：均未出現CD25表達異常增高,CD44表達都有所增高；CD4/CD8比例較單純活化T細胞降低。 第三部分動物實驗模型的建立方法 1.移植細胞的準備：制備C57BL/6小鼠BMCs,調濃度為2.5×107/ml;Stemcell磁珠負選法收集C57BL/6小鼠脾臟內CD3+T細胞。 2.將BALB/c小鼠分為A～E五組,全部給予60Co-γ射線致死性TBI(5G

7、y,100cGy/min),同日尾靜脈注射5×106 BMCs,按不同分組分別給予0.2ml PBS、1×106、3×106、5×106及7×106個CD3+T細胞。 3.移植后觀察小鼠體重、毛發(fā)、皮膚及生存狀況。 4.實驗數據的統計學分析。結果1D、E兩組小鼠移植后期出現體重減輕、少動、翹毛、腹瀉等GVHD表現,A、B、C三組未出現。2 E組小鼠肝臟、脾臟出現典型病理學GVHD表現。 結論:構建的逆轉錄病毒載體

8、pMSC-YCD-GFP能夠轉染活化的小鼠T淋巴細胞,并使其表達YCD蛋白,后者可以高效催化5-FC轉化為細胞毒性產物并殺傷T細胞,殺傷過程產生的旁觀者效應較弱,不會大范圍殃及“無辜”。YCD基因的插入并未影響轉基因T細胞的免疫功能,本實驗方法保留了相當數量的原始細胞,后者較記憶細胞更易誘發(fā)GVHD;淋巴細胞歸巢受體CD44表達增高說明細胞具有較強的遷徙至所需組織或器官并發(fā)揮作用的能力；轉基因T細胞較單純活化細胞CD4/CD8比例降低,