胞嘧啶脫氨酶APOBEC3s在肝細(xì)胞肝癌發(fā)病機(jī)制中的作用.pdf

1、已知HBV感染是肝細(xì)胞肝癌的高危因子之一,其中HBV編碼的HBx蛋白被認(rèn)為主要參與了肝細(xì)胞肝癌的發(fā)病過程.雖然對HBx在肝細(xì)胞肝癌中的作用機(jī)制的研究已有不少,但其中許多結(jié)果相互矛盾.因此,目前關(guān)于HBx在肝細(xì)胞肝癌發(fā)病過程中的確切作用機(jī)理依然沒有定論.近年的一些研究顯示野生型HBx在肝細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)出促進(jìn)細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)化的作用,而一些分離自肝癌組織的HBx突變體,尤其是C端截短型的HBx突變體,則表現(xiàn)出抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用

2、.這些研究結(jié)果對肝細(xì)胞肝癌發(fā)生過程中HBx的作用提出了新的解釋,指出了新的方向.然而目前所報道的C端截短型HBx突變體之間突變模式各不相同,突變的原因也不明確,而且沒有研究證明在肝細(xì)胞肝癌的前期病變----慢性HBV感染的肝組織內(nèi)也分離到這種C端截短型HBx突變體.因此本研究從檢測慢性HBV感染的肝組織和HBV陽性肝癌組織內(nèi)HBX基因突變?nèi)胧?通過體外轉(zhuǎn)染研究APOBEC3s引起HBX基因突變模式,探討C端截短型HBx突變體產(chǎn)生的機(jī)制.

3、進(jìn)而體外檢測C端截短型HBx對細(xì)胞增殖的影響,探討其在肝細(xì)胞肝癌發(fā)病機(jī)理中的作用. 第一部分:慢性HBV感染者肝組織和HBV陽性肝細(xì)胞肝癌組織內(nèi)HBX基因突變模式研究 目的:本研究第一部分首先檢測慢性HBV感染患者肝組織內(nèi)和HBV陽性的肝細(xì)胞肝癌病人癌組織標(biāo)本內(nèi)HBX基因的突變情況,并對兩種標(biāo)本內(nèi)HBX基因突變模式的特點(diǎn)進(jìn)行分析,對比兩種HBX基因突變模式之間是否存在相關(guān)性,尤其是是否存在與已報道的HBx突變類型相似的C

4、端截短型HBx突變體.在兩種組織標(biāo)本內(nèi)是否存在相同的C端截短型HBx突變體. 方法:收集慢性HBV感染者肝穿組織標(biāo)本和HBV陽性的肝細(xì)胞肝癌組織標(biāo)本,提取DNA.通過3D-PCR方法擴(kuò)增HBX基因,將HBX基因擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到克隆載體內(nèi),挑取并擴(kuò)增單克隆質(zhì)粒,回收質(zhì)粒后通過DNA測序的方法來檢測HBX基因的突變.通過DNA序列對比軟件將所測得的HBX基因序列進(jìn)行多序列對比分析,分析兩種組織標(biāo)本內(nèi)HBX基因的突變模式,以及突變對HB

5、x蛋白序列的影響.對比兩種組織標(biāo)本內(nèi)HBX基因及其編碼的HBx蛋白突變模式是否一致. 結(jié)果:在所檢測的7例慢性HBV感染者肝穿標(biāo)本內(nèi),有3例標(biāo)本內(nèi)檢測到HBX基因存在G->A超突變.而且有部分HBX基因內(nèi)發(fā)生在第359位和第360位鳥苷酸的G->A突變導(dǎo)致色氨酸密碼子TGG突變終止密碼子TAA,這種突變導(dǎo)致HBX基因提前終止產(chǎn)生C端截短型的HBx突變體蛋白.在所檢測的2例HBV陽性的肝細(xì)胞肝癌組織內(nèi),所擴(kuò)增的HBX基因內(nèi)也檢測到

6、與慢性HBV感染者肝穿標(biāo)本內(nèi)相似的G->A超突變和C端截短型HBx突變體存在.本研究所發(fā)現(xiàn)的C端截短型HBx突變體在現(xiàn)有的研究中未見報道,該突變體在某些慢性HBV感染者肝穿組織內(nèi)和HBV陽性肝細(xì)胞肝癌組織內(nèi)同時存在,提示可能與HBV相關(guān)的肝細(xì)胞肝癌有關(guān).雖然有研究報道慢性HBV感染過程中HBV基因的突變可能來源于逆轉(zhuǎn)錄酶出錯或HBV基因組與宿主細(xì)胞基因組的重組.但最近的研究證實胞嘧啶脫氨酶APOBEC3s家族能夠在HBV由前基因組RNA

7、逆轉(zhuǎn)錄為基因組DNA的過程中編輯新合成的單鏈cDNA使之產(chǎn)生G->A超突變,提示APOBEC3s家族很可能是HBV基因組發(fā)生突變的主要原因.然而APOBEC3s編輯HBV基因組產(chǎn)生的突變在HBV基因組內(nèi)不同部位之間是否存在差異,突變對于HBV相關(guān)蛋白尤其是HBx蛋白會產(chǎn)生怎樣的影響現(xiàn)在還不清楚. 第二部分:胞嘧啶脫氨酶APOBEC3s編輯產(chǎn)生的C端截短型HBx突變體在肝細(xì)胞肝癌發(fā)病機(jī)制中的作用 目的:檢測APOBEC3s

8、家族編輯HBV基因組產(chǎn)生突變的特點(diǎn),尤其是HBX基因突變的模式與慢性HBV感染者和HBV陽性的肝細(xì)胞肝癌組織內(nèi)的HBX基因突變是否存在相關(guān)性,是否會產(chǎn)生相似的C端截短型HBx突變體.進(jìn)而探討APOBEC3s編輯產(chǎn)生的HBx突變體在肝細(xì)胞肝癌發(fā)病機(jī)制中的作用. 方法:通過體外共轉(zhuǎn)染實驗檢測APOBEC3s家族對HBV基因組的突變作用,分析APOBEC3s所引起的突變在HBV基因組內(nèi)不同區(qū)域之間的分布特點(diǎn).分析APOBEC3s所引起

9、的突變的特點(diǎn),尤其是HBX基因的突變模式,并與慢性HBV感染者和HBV陽性的肝細(xì)胞肝癌組織內(nèi)的HBX基因突變模式進(jìn)行對比,試圖解釋體內(nèi)HBX基因突變的原因.同時根據(jù)HBV感染時參與體液免疫的分子及用于HBV感染治療的藥物,選擇干擾素作為誘導(dǎo)劑,研究APOBEC3s家族在肝細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)調(diào)控,進(jìn)而揭示HBV感染過程中APOBEC3s家族編輯HBV基因組的病理生理學(xué)機(jī)理.通過體外轉(zhuǎn)染實驗研究所發(fā)現(xiàn)的C端截短型HBx突變體對細(xì)胞增殖的影響,進(jìn)而

10、研究其分子機(jī)制,探討其在肝細(xì)胞肝癌發(fā)生過程中的作用. 結(jié)果:體外APOBEC3s和HBV共轉(zhuǎn)染實驗發(fā)現(xiàn)A3B、A3C、A3F和A3G在細(xì)胞內(nèi)都可以編輯HBV基因組產(chǎn)生G->A超突變,其突變的熱點(diǎn)區(qū)域在HBX基因.進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)干擾素可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞系和原代肝細(xì)胞內(nèi)APOBEC3s家族的表達(dá).而且在這些APOBEC3s家族編輯產(chǎn)生的HBX基因突變中也存在與慢性HBV感染者肝穿組織和HBV陽性肝細(xì)胞肝癌組織內(nèi)相同位置終止的C端截短

11、型HBx突變體.體外研究這種C端截短型HBx突變體的生物學(xué)功能發(fā)現(xiàn),與野生型HBx促進(jìn)細(xì)胞凋亡抑制細(xì)胞增殖不同,C端截短型HBx突變體具有通過影響細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)而促進(jìn)細(xì)胞增殖的功能.提示這種APOBEC3s編輯產(chǎn)生的C端截短型HBx突變體可能參與了肝細(xì)胞肝癌的發(fā)病過程.腫瘤的發(fā)病機(jī)制中某些重要基因的突變被認(rèn)為是原因之一,雖然目前關(guān)于腫瘤中基因突變的研究很多,但多數(shù)基因突變的原因仍然不明.由于APBOEC3s家族具有編輯單鏈DNA

12、產(chǎn)生基因突變的功能,該家族成員能否引起細(xì)胞基因組DNA產(chǎn)生突變也成為許多學(xué)者關(guān)心的問題.雖然目前只有A3B和A3C在細(xì)菌內(nèi)引起基因組產(chǎn)生突變的報道,但相關(guān)的研究仍然是大家關(guān)注的熱點(diǎn).A3B不同于其他已知的能誘導(dǎo)產(chǎn)生突變的APOBEC3s家族成員,該蛋白被證明主要分布于細(xì)胞核內(nèi),而且在正常非增殖組織中表達(dá)水平普遍很低,而在某些腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)較高.提示A3B的高表達(dá)有可能參與了某些腫瘤的發(fā)生過程.但目前有關(guān)A3B在肝細(xì)胞肝癌內(nèi)的表達(dá)情況還未

13、見報道. 第三部分:APOBEC3B異常表達(dá)與肝細(xì)胞肝癌的關(guān)系 目的:檢測A3B在肝細(xì)胞肝癌及其配對癌旁組織內(nèi)的表達(dá)特點(diǎn),A3B在肝癌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)對細(xì)胞增殖的影響.進(jìn)而探討A3B與肝細(xì)胞肝癌的關(guān)系. 方法:通過檢測A3B在肝細(xì)胞肝癌和配對癌旁組織內(nèi)的表達(dá)情況,并與其他.APOBEC3s家族進(jìn)行比較.通過免疫熒光技術(shù)和EGFP融合蛋白表達(dá)方法檢測A3B在肝癌細(xì)胞內(nèi)的分布.通過體外轉(zhuǎn)染實驗檢測A3B高表達(dá)對肝癌細(xì)胞系H

14、epG2細(xì)胞增殖的影響.通過人腫瘤信號通路相關(guān)基因芯片方法檢測A3B高表達(dá)對人腫瘤信號通路相關(guān)基因表達(dá)的影響.進(jìn)而探討A3B高表達(dá)在肝細(xì)胞肝癌發(fā)病中的作用. 結(jié)果:與其他APOBEC3s家族成員不同,A3B在肝細(xì)胞肝癌組織內(nèi)的表達(dá)普遍高于其在配對癌旁組織內(nèi)的表達(dá).而且.A3B在肝癌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時主要分布于細(xì)胞核內(nèi).體外研究A3B生物學(xué)功能發(fā)現(xiàn)A3B在細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)可以促進(jìn)細(xì)胞增殖,其機(jī)理可能是調(diào)控某些與腫瘤相關(guān)的基因表達(dá)水平.提示A

15、3B高表達(dá)可能與肝細(xì)胞肝癌相關(guān). 結(jié)論:本研究證實在慢性HBV感染過程中參與體液免疫的干擾素可以誘導(dǎo)肝細(xì)胞內(nèi)APOBEC3s家族的表達(dá),被誘導(dǎo)表達(dá)的APOBEC3s通過脫氨酶活性編輯HBV基因組使之產(chǎn)生G->A超突變,HBX基因是熱點(diǎn)突變區(qū).持續(xù)的HBV感染導(dǎo)致APOBEC3s家族被持續(xù)誘導(dǎo)表達(dá)可以通過編輯,HBX基因引起G->A超突變產(chǎn)生一種C端截短型HBx突變體,這種C端截短型HBx突變體具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用,使表達(dá)這種突