心臟酶corin在高血壓發(fā)病機制中的作用.pdf

1、本文對心臟酶corin在高血壓發(fā)病機制中的作用進行了研究。本研究分為兩個部分：
　　第一部分：
　　目的：Corin是在心肌細胞中發(fā)現(xiàn)的一種Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶,其主要功能是將心房利鈉肽前體(pro-atrial natriuretic peptide,pro-ANP)轉化為有活性的心鈉肽(ANP),從而調節(jié)心臟功能和血壓。錨定在細胞膜上的corin可被ADAM10(a disintegrin and metalloprot

2、einase domain-containing protein10)及corin自我切割,生成~180、~160和~100 kDa的可溶性片段。故血漿及細胞培養(yǎng)上清中可檢測到可溶性corin,且血漿中可溶性corin水平與心功能及腎功能相關。Corin在血壓調節(jié)中發(fā)揮重要作用,Corin基因敲除小鼠會發(fā)生高血壓及妊娠高血壓。在人類也發(fā)現(xiàn)與高血壓及妊娠高血壓發(fā)生相關的CORIN基因突變。但迄今,高血壓患者血漿中的corin水平國內外尚未

3、見報道,也未見高血壓人群中大樣本分析CORIN基因變異的研究。本研究中,我們將檢測高血壓患者血漿中可溶性corin水平,并對高血壓患者CORIN基因進行測序分析,發(fā)現(xiàn)CORIN基因突變和單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP),并進一步研究CORIN基因變異對其分子機構和功能的影響,從而了解corin在高血壓病理過程中的作用及機制。
　　方法：⑴采集正常人和高血壓患者的血液樣本,以ED

4、TA為抗凝劑,離心后獲得血漿和血細胞,分別保存?zhèn)溆?。⑵利用酶?lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)方法檢測480例正常人和594例高血壓患者血漿可溶性corin水平,對所得的數(shù)據進行統(tǒng)計學分析。⑶提取正常人和高血壓患者血細胞中的基因組DNA,作為聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)的模板,擴增CORIN基因的22個外顯子,對所得PCR產物進

5、行DNA測序。⑷分析CORIN基因變異所導致的氨基酸改變在corin蛋白結構中的位置。
　　結果：①對中國高血壓患者和正常人群血漿可溶性 corin水平進行了測定和比較分析,發(fā)現(xiàn)高血壓患者血漿可溶性corin水平顯著低于正常人(0.6±0.3 vs.0.9±0.4 ng/mL,p<0.0001)。②對高血壓患者和正常人群分別進行了男性和女性的分組比較。發(fā)現(xiàn)在正常人中,男性血漿可溶性 corin水平顯著高于女性(0.9±0.03 v

6、s.0.8±0.03 ng/mL, p=0.005);在高血壓患者中,血漿可溶性corin水平同樣是男性高于女性(0.7±0.01 vs.0.6±0.02 ng/mL,p=0.005)。由此可見血漿可溶性corin水平與性別相關。③對高血壓患者和正常人群中男性與女性按年齡段進行分組比較時,發(fā)現(xiàn)同一性別各年齡段之間的corin水平無顯著差異。④我們發(fā)現(xiàn)并定義了insA(c.102_103insA)、C13Y(131A→G)、D95Y(37

7、6G→T)、L334W(1094G→T)和H525R(1667A→G)等CORIN基因SNPs,其中SNP insA在高血壓患者群體中出現(xiàn)的頻率明顯高于正常人群(5.7 vs.0.9％)。⑤此外,在高血壓患者中篩查到CORIN基因突變,R349H(1138G→A)、R530S(1683T→G)、P866S(2689T→C)及T924M(2864C→T),這些突變在正常人群中沒有檢測到。
　　結論：對中國高血壓患者和正常人群的血漿可

8、溶性corin水平進行了檢測,發(fā)現(xiàn)高血壓患者的血漿可溶性corin水平比正常人顯著降低,這一結果提示corin功能受損可能與高血壓的發(fā)病機制相關。比較男性與女性血漿可溶性corin水平,發(fā)現(xiàn)在正常人和高血壓患者群體中,女性血漿可溶性corin水平都顯著低于男性。我們的結果提示, corin水平的降低可能為高血壓的診斷提供新的依據。在高血壓患者群體中存在CORIN基因突變和SNPs,其中SNP insA在高血壓患者群體中出現(xiàn)的頻率遠遠高于

9、正常人群,而基因突變R349H、T924M、R530S只存在于特定的高血壓患者家系,提示這些 CORIN基因突變和 SNPs可能與高血壓發(fā)病機制相關。
　　第二部分：
　　目的：Corin作為一種Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶,大量表達于心肌細胞膜上,從而發(fā)揮其活化pro-ANP的生物學功能。作為一種跨膜蛋白,corin生物學活性的發(fā)揮依賴于其蛋白質在細胞膜上的正確定位,而在早期的研究中發(fā)現(xiàn),當corin蛋白的胞質尾部變短時,會顯著地

10、減少corin在細胞膜上的定位,進而抑制corin的功能。在高血壓患者群體中發(fā)現(xiàn)了一系列CORIN基因SNPs和突變,其中SNP insA位于corin蛋白質分子胞質尾部,或許會影響corin蛋白在細胞膜上的定位,抑制其活化pro-ANP的功能,進而參與高血壓發(fā)病過程。因此,本研究旨在研究insA對corin蛋白的表達、細胞膜定位及功能的影響。
　　方法：⑴以野生型(WT)corin質粒為模板,運用基因定點突變法,構建 insA

11、corin質粒。⑵將野生型及突變體質粒轉染人胚腎(human embryonic kidney,HEK)293細胞,用含有pro-ANP的上清孵育轉染后的HEK293細胞,然后收集上清和細胞,用免疫共沉淀(immunoprecipitation,IP)和蛋白印跡法(Western blotting)方法檢測corin活化pro-ANP的情況,以及corin的表達與活化情況,從細胞水平研究insA對corin的功能、表達和活化的影響。⑶將

12、野生型和突變體質粒轉染 HEK293細胞后,以生物素標記膜蛋白(biotin-labelling)和流式細胞術(flow cytometry)的方法檢測corin蛋白在細胞膜上的表達情況,研究基因突變對corin蛋白在細胞膜上的定位的影響。⑷野生型和突變體質粒轉染 HEK293細胞后,用免疫熒光染色(immunofluorescence staining)的方法在共聚焦顯微鏡下觀察corin蛋白質的亞細胞定位情況,研究基因突變對cori

13、n蛋白質在細胞內的合成與轉運的影響。
　　結果：①CORIN基因SNP insA存在于高血壓患者(23/401,5.7％)和正常人群(2/217,0.9％),高血壓患者中出現(xiàn)頻率顯著高于正常人群(p<0.01)。②轉染HEK293細胞后,發(fā)現(xiàn)insA并不影響corin在細胞中的表達,但是在功能研究中發(fā)現(xiàn),insA活化pro-ANP的能力顯著降低,其活性只有WT的41.3±8.5％(n=4,p<0.01)。③Corin酶原活化的實驗

14、中,發(fā)現(xiàn)insA的~40 kDa活化帶占全部蛋白表達量的4.0±1.0％,顯著低于WT(12.7±1.8％)(n=5,p<0.01)。結果表明,insA并不影響corin蛋白在細胞中的表達,但是會顯著減少corin的活化。④生物素標記膜蛋白的實驗中,發(fā)現(xiàn)在生物素標記的HEK293細胞中,insA在細胞膜上的表達較WT、活化位點突變體R801A和蛋白酶活性位點突變體S985A明顯降低。同時,流式細胞術也證實了這一結果,轉染 WT之后的HE

15、K293細胞表面corin陽性率為32.7±4.9％,而insA的陽性率為7.9±2.1％(p<0.01 vs. WT)。結果表明,insA影響了corin蛋白在細胞膜上的錨定。⑤免疫熒光實驗中,發(fā)現(xiàn)錨定到細胞膜上的insA corin蛋白顯著少于WT。亞細胞定位顯示一部分insA corin滯留在高爾基體管網結構中,提示insA corin蛋白質合成過程中,蛋白從高爾基體運輸出來的過程受阻,影響了corin蛋白在膜上的錨定和酶原活化,

16、進而影響其功能。⑥Western blotting檢測脫落到培養(yǎng)上清中corin蛋白,發(fā)現(xiàn)WT產生~180、~160和~100 kDa三條可溶性片段,而insA的~180的含量顯著少于WT,~100 kDa條帶幾乎檢測不到。insA和WT的~160 kDa片段含量無明顯差異。⑦ELISA檢測發(fā)現(xiàn)25名含有insA corin等位基因的個體的血漿可溶性corin水平顯著低于215名正常個體(0.6±0.1 vs.0.9±0.02 ng/m

17、L,p<0.001)。
　　結論：在國內高血壓患者中首次發(fā)現(xiàn)并定義了一種corin變異體并命名為insA,該變異體改變corin胞質尾部氨基酸序列,所編碼的corin蛋白胞質尾部縮短了29個氨基酸,本研究證明,insA在細胞膜上的表達量和酶原活化都有顯著降低,進而影響了insA corin的功能。且高血壓患者中insA出現(xiàn)的頻率顯著高于正常人,提示著insA可能參與到高血壓疾病的發(fā)病過程中。同時,本研究還揭示corin胞質尾部氨基