CyPA、褪黑素在高血壓左室肥厚中的作用及其機制研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、本文主要從以下幾個部分展開論述:
  第一部分 褪黑素通過CyPA/CD147信號通路抑制血管緊張素Ⅱ誘導的心肌細胞肥大
  目的:
  1.本研究通過建立血管緊張素Ⅱ或親環(huán)素A誘導的H9C2心肌細胞肥大模型,觀察褪黑素對心肌細胞表面積、[3H]-亮氨酸的摻入量以及心肌細胞肥大特征性分子表達等方面的影響。
  2.明確CyPA/CD147信號通路在AngⅡ誘導的心肌細胞肥大中的作用。
  3.探討褪黑素保護

2、心肌肥厚的可能作用機制。
  方法:
  1.細胞培養(yǎng):
  復(fù)蘇并培養(yǎng)大鼠H9C2心肌細胞至理想細胞密度。①以一定濃度的血管緊張素Ⅱ刺激H9C2心肌細胞發(fā)生肥大反應(yīng),加入不同濃度的褪黑素預(yù)處理細胞,觀察褪黑素對血管緊張素Ⅱ誘導的H9C2心肌細胞的保護作用。②應(yīng)用環(huán)孢素A預(yù)處理H9C2細胞,觀察抑制親環(huán)素A在血管緊張素Ⅱ誘導的H9C2心肌細胞肥大中的保護作用。③親環(huán)素A刺激H9C2細胞發(fā)生肥大,以不同濃度的褪黑素預(yù)處理

3、細胞,觀察褪黑素對親環(huán)素A誘導的H9C2細胞的保護作用。
  2.[3H]-亮氨酸摻入試驗:
  用于測定H9C2心肌細胞蛋白質(zhì)合成速率。
  3.細胞免疫熒光法:
  測定α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、CyPA及CD147的蛋白水平以及細胞內(nèi)的定位,并用軟件分析測量心肌細胞表面積。
  4.蛋白印跡(Western Blot):
  收集各組細胞提取蛋

4、白,分別檢測α-SMA、CyPA、CD147、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2 (nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate oxidase 2,NOx2)等蛋白表達水平。
  5.逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR):
  用于在基因水平檢測各組細胞中α-SMA、β心肌肌球蛋白重鏈(β

5、-myosin heavy chain,β-MHC)、心鈉肽(atrial natriuretic peptide,ANP) mRNA水平的變化。
  結(jié)果:
  1.褪黑素預(yù)處理抑制了血管緊張素Ⅱ誘導的H9C2心肌細胞肥大
  與對照組相比,100nmol/L AngⅡ刺激H9C2細胞24小時后,[3H]-亮氨酸的摻入量增加,H9C2細胞表面積增大,心肌細胞肥大特征性分子mRNA表達量增加,提示H9C2心肌細胞發(fā)生了

6、肥大反應(yīng);且Western Blot、細胞免疫熒光法以及PCR等檢測方法均顯示肥厚性蛋白α-SMA的表達水平明顯升高,兩者之間有顯著性差異(p<0.05)。而給予褪黑素預(yù)處理后減輕了上述變化,且呈劑量依賴性(p<0.05),褪黑素濃度達500umol/1時作用最強。
  2.褪黑素可抑制血管緊張素Ⅱ誘導的H9C2心肌細胞發(fā)生氧化反應(yīng)
  與對照組比較,DCFH-DA法測定的Ang Ⅱ組細胞ROS水平,以及Western Bl

7、ot法檢測顯示的氧化性蛋白NOx2的表達水平均明顯升高(p<0.05);而經(jīng)過不同劑量褪黑素的預(yù)處理可明顯減少上述變化,同樣呈劑量依賴性(p<0.05)。
  3.CyPA/CD147信號轉(zhuǎn)導通路參與了血管緊張素Ⅱ誘導的H9C2心肌細胞肥大過程
  與對照組相比,100nmol/L AngⅡ刺激H9C2細胞24小時后,Western Blot和細胞免疫熒光法檢測均顯示CyPA及其下游因子CD147的表達水平均明顯升高(p<0

8、.05);而CyPA抑制劑CsA預(yù)處理后CyPA、CD147的表達水平明顯減低(p<0.05)。同時,CCK8實驗結(jié)果顯示,CsA對H9C2心肌細胞的增值無明顯影響(p>0.05)。
  結(jié)論:
  1.褪黑素能顯著抑制血管緊張素Ⅱ或CyPA誘導的H9C2心肌細胞發(fā)生肥大。
  2.褪黑素通過抗氧化作用抑制血管緊張素Ⅱ誘導的H9C2心肌細胞肥大,其作用機制至少部分是通過CyPA/CD147信號通路實現(xiàn)的。
  第

9、二部分 血清CyPA、褪黑素水平與高血壓左室肥厚的相關(guān)性研究
  目的:
  1.研究高血壓左室肥厚患者血清褪黑素、CyPA表達水平。
  2.探討血清褪黑素、CyPA與高血壓左室肥厚的相關(guān)性,并統(tǒng)計分析高血壓左室肥厚的其他獨立危險因素。
  3.進一步探討高血壓左室肥厚患者中褪黑素、CyPA兩者之間的相關(guān)性。
  方法:
  收集2015年10月至2016年10月期間就診山東省胸科醫(yī)院心內(nèi)科門診及健

10、康查體中心的原發(fā)性高血壓患者135例,據(jù)心臟彩超檢查計算出的左室質(zhì)量指數(shù)(left ventricular mass index,LVMI)結(jié)果分為高血壓左室肥厚組[LVH(+)]70例及高血壓非左室肥厚組[LVH(-)] 65例。詳細采集所有實驗者病史,并測量血壓(blood pressure)、心率(heart rate)、身高(height)、體重(weight)等;測定血清中CyPA、melatonin、ET-1、CRP、IL-

11、6、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2 (nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate oxidase 2,NOx2)、NT-proBNP、肌鈣蛋白Ⅰ(troponin Ⅰ,TnⅠ)等因子的水平。所有入選者均進行高頻超聲檢查測定左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular internal diameter at end-diastole,LVIDd)、左室收縮末期內(nèi)徑(left ventr

12、icular internal diameter at end-systole,LVIDs)、室間隔厚度(interventricular septal thickness,IVST)、左室射血分數(shù)(left ventricular ejection fraction,EF)、左室后壁厚度(left ventricular posterior wall thickness,LVPWT)。左室心肌重量(left ventricular m

13、ass,LVM)、左室質(zhì)量指數(shù)(left ventricular mass index,LVMI)和左室相對室壁厚度(relative wall thickness,RWT)均分別采用公式計算。
  所有計量資料數(shù)據(jù)采用均數(shù)士標準差表示,計數(shù)資料用例數(shù)和百分數(shù)描述,采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行相關(guān)數(shù)據(jù)分析。用t檢驗和方差分析比較高血壓左室肥厚組[LVH(+)]和高血壓非左室肥厚組[LVH(-)]間計量資料,x2檢驗比較兩組間

14、計數(shù)資料。采用Pearson和Partial相關(guān)性分析方法進行變量之間的相關(guān)分析,得出與高血壓左室肥厚明顯相關(guān)的變量;通過多元線性回歸統(tǒng)計分析LVH的獨立危險因素。差異有統(tǒng)計學意義定義為p<0.05。
  結(jié)果:
  1.高血壓左室肥厚組[LVH(+)]、高血壓非左室肥厚組[LVH(-)]基本資料和一般血液檢查資料比較
  LVH(+)組與LVH(-)組相比,年齡(age)、糖尿病病史(diabetes)、吸煙史(sm

15、oking index)、飲酒史(drinking index)、各種主要降壓藥物使用情況、舒張壓(DBP)、白細胞(WBC)、膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、空腹血糖(FPG)、肌酐(Scr)、尿酸(UA)、ALT(丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)、AST(門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)等因素無顯著性差異(p>0.05)。兩組在女性(female)患病數(shù)、冠心病

16、(coronary artery disease,CAD)患病數(shù)、收縮壓(SBP)水平、高血壓病程(hypertension)、體重指數(shù)(body mass index,BMI)等均有明顯差異(p<0.05),LVH(+)組高于LVH(-)組。
  2.高血壓左室肥厚組[LVH(+)]、高血壓非左室肥厚組[LVH(-)]心臟超聲指標比較
  與LVH(-)組相比,LVH(+)組的LVM、LVMI、LVIDd、IVST、LVP

17、WT、RWT明顯升高,有顯著性差異(p<0.001);但兩組間LVEF、LVIDs之間無顯著性差異(p>0.05)。
  3.高血壓左室肥厚組[LVH(+)]、高血壓非左室肥厚組[LVH(-)]血清CyPA、melatonin、ET-1、CRP、IL-6、NOx2、cTnI、NT-proBNP等水平的比較
  與LVH(-)組相比,LVH(+)組血清中CyPA、ET-1、IL-6水平均有升高,血清NOx2、melatonin

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