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1、研究背景和實驗?zāi)康模?NeuroD是一種bHLH(basic helix-loop-helix,堿性螺旋-環(huán)-螺旋)轉(zhuǎn)錄因子。在爪蟾的胚胎中,過表達外源NeuroD可以將外胚層中所有類型的細胞分化成為成熟的神經(jīng)元。在胰島素瘤細胞中,NeuroD可以結(jié)合并激活胰島素啟動子。NeuroD基因敲除的小鼠,位于早期分化中的胰腺內(nèi)分泌細胞以及神經(jīng)系統(tǒng)的某些品系的細胞死亡,結(jié)果導(dǎo)致胰腺中的胰島細胞、小腦、海馬結(jié)構(gòu)及內(nèi)耳感覺神經(jīng)節(jié)細胞的缺失
2、,產(chǎn)生糖尿病及包括共濟失調(diào)、耳聾等神經(jīng)系統(tǒng)方面的功能障礙。一系列功能獲得和喪失的實驗證實NeuroD調(diào)控不同組織中細胞的存活和分化。了解NeuroD作為轉(zhuǎn)錄因子在胰腺組織和神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育及其功能,為今后診斷和治療相關(guān)的疾病提供有價值的幫助,我們擬重組大鼠NeuroD基因真核質(zhì)粒表達載體。 實驗方法: 1.NeuroD cDNA克隆從新生大鼠小腦中提取總RNA,巢式PCR擴增得到NeuroD基因,回收并純化;Ligat
3、ion Mix連接酶連接pMD19-T載體,轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌JM109后經(jīng)藍自篩選;小量抽提重組克隆質(zhì)粒DNA,應(yīng)用限制性內(nèi)切酶NheI和Xhol酶切鑒定陽性克隆并對陽性重組質(zhì)粒。 2.構(gòu)建NeuroD基因真核質(zhì)粒表達載體和序列分析用限制性內(nèi)切酶NheI和XhoI對pMD19-T-NeuroD和pcDNA3.1A雙酶切,分別回收純化,以T4連接酶將二者連接,轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5a。小量抽提重組質(zhì)粒DNA,NheI和XhoI篩選鑒定重
4、組質(zhì)粒pcDNA3.1A-NeuroD并進行基因測序。 結(jié)果: 1.NeuroD基因克隆 RT-PCR擴增得到的cDNA為1kb,與GenBank中NeuroD cDNA的長度一致。NeuroD基因片段與克隆載體pMD19-T連接后轉(zhuǎn)化,經(jīng)藍白篩選得到大量菌落,PCR擴增鑒定和雙酶切鑒定得到陽性重組克隆pMD19-T-NeuroD。 2.NeuroD基因質(zhì)粒表達載體構(gòu)建雙酶切重組質(zhì)粒pMD19-T-Neur
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