肝細胞生長因子真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建、鑒定及表達.pdf

1、目的: 本實驗通過設(shè)計特定引物，從含人肝細胞生長因子(human hepatocyte growth factor hHGF)的人肝臟組織總RNA中，利用聚合酶鏈反應(yīng)擴增出hHGF cDNA，構(gòu)建重組pcDNA3.1+-hHGF真核表達質(zhì)粒，繼而轉(zhuǎn)染人胚腎293T細胞，應(yīng)用ELISA方法檢測細胞培養(yǎng)液上清中肝細胞生長因子表達，并為下一步研究肝細胞生長因子奠定基礎(chǔ)。 方法: 1.設(shè)計兩端合適酶切位點的引物，利用高保真、長片

2、段PCR技術(shù)擴增制備HGF cDNA，利用瓊脂糖膠回收試劑盒回收純化目的片段。 2.利用TA克隆技術(shù)，將hHGF cDNA與T載體pGEM-T進行連接，轉(zhuǎn)化入DH5 α感受態(tài)細胞，構(gòu)建pGEM-T-hHGF。經(jīng)藍白斑篩選后，抽提質(zhì)粒進行酶切鑒定和DNA測序。 3.將測序正確的pGEM-T-hHGF用NheI和BamH I依次酶切，將所得hHGF cDNA片段與同樣酶切亞克隆入真核表達載體pcDNA3.1+質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)化E

3、.coli DH5α，構(gòu)建pcDNA3.1+-hHGF重組質(zhì)粒。隨機挑選白色菌落，抽提質(zhì)粒進行酶切鑒定和DNA測序。并中量制備質(zhì)粒。 4.將重組質(zhì)粒pcDNA3.1+-hHGF轉(zhuǎn)染293T細胞，應(yīng)用ELISA方法檢測肝細胞生長因子在293T細胞中的表達。 結(jié)果: 1.將以人肝組織總RNA為模板擴增的PCR擴增產(chǎn)物進行0.6％瓊脂糖凝膠電泳，產(chǎn)物主要為單一、清晰條帶，大小約為2.2kb。 2.對pGEM-T

4、-hHGF和pcDNA3.1+-hHGF分別進行酶切鑒定及DNA序列分析。酶切鑒定表明HGF cDNA為2211bp的DNA片段。兩個重組質(zhì)粒測序結(jié)果相同，且與Genbank中人類(Homo Sapiens)HGF基因序列一致，證實pGEM-T-hHGF和pcDNA3.1+-hHGF重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。 3.將重組質(zhì)粒pcDNA3.1+-hHGF轉(zhuǎn)染293T細胞，應(yīng)用ELISA方法于轉(zhuǎn)染后12、24、48、72小時檢測到肝細胞生長