凝血因子Ⅸ無義突變真核表達(dá)載體的構(gòu)建、鑒定及其表達(dá).pdf

1、研究目的：
　　 血友病B(hemophilia B，HB)是凝血因子Ⅸ(factorⅨ，F(xiàn)Ⅸ)基因缺陷引起血漿FⅨ含量或活性下降所導(dǎo)致的一種連鎖隱性遺傳性出血疾病，男性中發(fā)病率約為1/30000，嚴(yán)重危害人民健康。FⅨ基因缺陷具有明顯異質(zhì)性，其中無義突變是導(dǎo)致重型HB的重要原因之一。本研究旨在構(gòu)建4種包含不同類型無義突變的FⅨ真核表達(dá)載體，為進(jìn)一步研究無義突變引起FⅨ表達(dá)量降低的機(jī)制及其治療奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：

2、r>　　 1.對(duì)血友病B突變數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，尋找FⅨ基因無義突變頻發(fā)位點(diǎn)。
　　 2.采用以PCR為基礎(chǔ)的定點(diǎn)突變法體外構(gòu)建FⅨ基因無義突變真核表達(dá)載體，并通過DNA序列分析進(jìn)一步鑒定證實(shí)。
　　 3.應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)將野生型、突變型FⅨ表達(dá)載體分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，同時(shí)進(jìn)行綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)共轉(zhuǎn)染，使用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率。
　　 4.采用實(shí)時(shí)

3、定量PCR檢測(cè)不同位點(diǎn)無義突變對(duì)FⅨ基因mRNA表達(dá)水平的影響并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；采用Western blot方法檢測(cè)野生型及各突變型FⅨ基因蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.R29X、R116X、W194X、R333X4種FⅨ基因無義突變的病例數(shù)集中，發(fā)生頻率較高。
　　 2.DNA序列分析證明，構(gòu)建的4個(gè)突變型質(zhì)粒除相應(yīng)位點(diǎn)無義突變外，未見其它突變，提示無義突變載體構(gòu)建成功。
　　 3.GFP共轉(zhuǎn)染

4、證實(shí)質(zhì)粒易于轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞并能在其中表達(dá)。
　　 4.野生型及各突變組真核表達(dá)載體可轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞株并能進(jìn)行表達(dá)。各突變組FⅨ基因mRNA表達(dá)水平與野生型相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.成功構(gòu)建4種發(fā)生頻率高的FⅨ無義突變真核表達(dá)載體，并驗(yàn)證了該表達(dá)載體可在COS-7細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。
　　 2.表達(dá)載體中的無義突變對(duì)FⅨ基因mRNA表達(dá)水平無影響，可能與實(shí)驗(yàn)采用的FⅨ基