人BRAF V600E突變體真核表達載體的構(gòu)建及表達.pdf

1、BRAF是RAS/RAF/MEK/ERK/MA/PK．通路重要的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，參與調(diào)控細胞內(nèi)多種生物學(xué)事件。在人類腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中，BRAF蛋白可能獨立于RAS蛋白而發(fā)揮作用，是潛在的診斷標記和治療靶點。在消化道腫瘤中，BRAF基因存在不同頻率的突變，可能影響它們的發(fā)生和發(fā)展，值得對該基因進一步研究。 目的：構(gòu)建野生型和V600E突變型人BRAF基因真核表達載體，轉(zhuǎn)染并篩選穩(wěn)定表達BRAF的胰腺癌細胞株，為探討B(tài)RAF

2、 V600E突變在胰腺癌發(fā)生和發(fā)展中的作用提供合適的細胞模型。 方法：將BRAF基因編碼序列分成5個片段：片段1：BRAFl-508(ECORI/Kpnll片段；片段2：BRAF508-1335(KpnI/XhoI)片段；片段3：BRAFl335-1843(XhoI/BamHI)片段；片段3’：BRAFl335．1843(XhoI/BamHI)片段(突變型1799T-A轉(zhuǎn)換)；片段4：BRAFl843-2301(BamHI/S

3、alI)片段。分別設(shè)計相應(yīng)的引物，進行PCR擴增，全合成拼接構(gòu)建野生型和V600E突變型BRAF基因cDNA序列，插入pUCm-T質(zhì)粒，進行序列測定，測序正確后將其亞克隆到真核表達載體pCMV-Myc，獲得pCMV-Myc．BRAF<'w>和pCMV-Myc-BRAF<'V600E>，測序驗證，利用脂質(zhì)體將重組載體轉(zhuǎn)染胰腺癌細胞株P(guān)anc-1，經(jīng)G418培養(yǎng)篩選獲得抗性細胞克隆，用RT-PCR和Western blot鑒定野生型和V60

4、0E突變型BRAF基因在Panc-1細胞中的表達。 結(jié)果：人工合成的5個片段1：BRAFl-508(EcoRI/KpnI)片段；片段2：BRAF508-1335(KpnI/XhoI)片段；片段3：BRAFl335．1843(XhoI/BamHI)片段；片段3’：BRAFl335-1843(XhoI/BamHI)片段(突變型：T1799A)；片段4：BRAFl843-2301(BamHI/SalI)片段，測序結(jié)果顯示序列正確，酶