抗?jié)h坦病毒鼠-人嵌合抗體真核表達載體的構(gòu)建及表達.pdf

1、漢坦病毒（Hantavirus）屬于布尼亞病毒科漢坦病毒屬，根據(jù)其抗原性和基因結(jié)構(gòu)的不同，可分為10多個型別。Hantavirus可引起兩種類型的急性傳染病，一類以高熱、彌漫性肺部炎癥和急性呼吸衰竭為主要表現(xiàn)，稱為漢坦病毒肺綜合征（hantavirus pulmonary syndrome，HPS），另一類以出血、高熱、腎功能損害為主要表現(xiàn)，稱為腎綜合征出血熱（hemorrhagic fever with renal syndrome，

2、HFRS）。迄今為止，在我國尚未發(fā)現(xiàn)HPS的報道，但我國是世界上受HFRS危害最嚴重的國家。該病在我國具有發(fā)病人數(shù)多、流行范圍廣、死亡率高等特點。此外，Hantavirus還是一種潛在的生物戰(zhàn)劑，有被恐怖分子利用的可能。而且目前臨床上尚未有能特異治療HFRS的有效藥物，因而更增加了HFRS的艱巨性和長期性。
　　用疫苗進行主動免疫和用抗體進行被動免疫治療是當(dāng)前預(yù)防和治療病毒性疾病的重要措施。近年來國內(nèi)外已研制出Hantavirus

3、的純化細胞培養(yǎng)滅活疫苗和純化乳鼠腦滅活疫苗，但這兩類疫苗在試用過程中表現(xiàn)出明顯不足。使用具有中和活性的單克隆抗體(monoclonal antibody,mAb)是在體內(nèi)、外抑制或阻斷病毒感染的有效的治療方法之一。早在上世紀八十年代中期本實驗室即研制出具有較高中和活性和保護性的抗Hantavirus mAb，并在國家863計劃支持下研制注射用抗HFRS病毒單克隆抗體制劑，現(xiàn)已完成臨床試驗。由于鼠源性mAb對人有潛在的免疫原性，可能引起超

4、敏反應(yīng)等副作用，因此，本課題擬在此基礎(chǔ)上對抗Hantavirus鼠源性mAb 3G1進行人源化改造，應(yīng)用基因重組技術(shù)，構(gòu)建鼠/人嵌合抗體基因，在哺乳動物細胞中表達并篩選出穩(wěn)定高效表達嵌合抗體的細胞系，純化表達的嵌合抗體并鑒定其生物學(xué)特性，為進一步研制特異治療HFRS的新型制劑奠定基礎(chǔ)。
　　1.構(gòu)建抗?jié)h坦病毒鼠/人嵌合抗體的真核表達載體
　　以pCI-neo-M和pCI-M載體為基礎(chǔ)，用ease2.1-cmv5分別替換pCI

5、-neo-M和pCI-M的啟動子MARs-mCMV改建真核表達載體，改構(gòu)后的載體命名為pCI-neo-ease2.1-cmv5-M和pCI-ease2.1-cmv5-M；獲得抗HTNV mAb 3G1的鼠/人嵌合輕鏈、重鏈基因，并分別將其克隆到pCI-neo-ease2.1-cmv5-M和pCI-ease2.1-cmv5-M真核表達載體中，經(jīng)雙酶切鑒定后分別獲得陽性重組質(zhì)粒pCI-neo-ease2.1-cmv5-vh-M和pCI-ea

6、se2.1-cmv5-vl-M，測序后證實載體構(gòu)建成功。
　　2.穩(wěn)定表達抗?jié)h坦病毒鼠/人嵌合抗體CHO-K1細胞系的建立與篩選
　　將上述含抗Hantavirus mAb 3G1鼠/人嵌合重鏈和輕鏈基因表達載體的JM-109擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，用紫外分光光度計定量,用脂質(zhì)體法按Lipofectamine TM 2000說明書轉(zhuǎn)染野生型CHO-K1細胞，在氨甲喋呤(MTX)和G418雙重篩選壓力下篩選穩(wěn)定、高效表達抗Hant

7、avirus嵌合抗體的細胞株，ELISA方法測定重組蛋白的表達。
　　3.抗?jié)h坦病毒鼠/人嵌合抗體的表達、鑒定及生物學(xué)活性檢測
　　擴大培養(yǎng)上述篩選出的穩(wěn)定、高效表達嵌合抗體的細胞系，收集其培養(yǎng)上清，超濾濃縮、除鹽后，用Protein AHP Spin Trap純化試劑盒純化。純化后進行SDS-PAGE和Western blot檢測，結(jié)果表明成功表達了抗Hantavirus鼠/人嵌合抗體。通過體外中和實驗檢測其中和活性，結(jié)果