人Canstatin真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其表達(dá)產(chǎn)物抗血管生成活性的測(cè)定.pdf

1、目的:構(gòu)建人canstatin重組分泌型真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞，初步鑒定該細(xì)胞培養(yǎng)液抑制血管生成的活性。方法:用RT-PCR方法從新鮮人胎盤臍帶組織中釣取canstatin全編碼區(qū)cDNA。將該片段重組入pUCm-T克隆載體中，重組載體經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切鑒定和DNA序列分析。從pUCm-T/canstatin克隆載體中，將人canstatincDNA亞克隆入分泌型真核表達(dá)載體pSecTag2B，構(gòu)建含人canstatincD

2、NA的重組質(zhì)粒pSecTag2B/canstatin。將該重組質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO-K1)細(xì)胞72h后，分別離心收集細(xì)胞和上清液，應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中canstatin基因的表達(dá)，SDS-PAGE電泳檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞和上清液中重組融合蛋白的表達(dá)，并用雞胚絨毛尿囊膜(CAM)實(shí)驗(yàn)初步鑒定其生物學(xué)活性。結(jié)果:成功獲得684bp人canstatin基因，測(cè)序證明canstatincDNA編碼序列與Genbank中報(bào)道的序列一致

3、。成功構(gòu)建人canstatincDNA分泌型真核表達(dá)載體pSecTag2B/canstatin，將此重組質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞，RT-PCR證實(shí)質(zhì)粒pSecTag2B/canstatin已成功轉(zhuǎn)染進(jìn)入CHO-K1細(xì)胞。離心收集轉(zhuǎn)染72h后的細(xì)胞和細(xì)胞上清液，在SDS-PAGE凝膠上均顯示出一條約30kD的融合蛋白條帶，與推測(cè)的蛋白大小相近，且細(xì)胞上清液中此蛋白條帶較細(xì)胞內(nèi)更明顯。該細(xì)胞上清液在體內(nèi)能抑制雞胚絨毛尿囊膜中微血管的生成

4、，實(shí)驗(yàn)組雞胚絨毛尿囊膜顏色蒼白，微血管生長(zhǎng)減慢，數(shù)目稀少，血管輪廓模糊不清；對(duì)照組雞胚絨毛尿囊膜顏色紅潤(rùn)，微血管生長(zhǎng)活躍，數(shù)目明顯增多，血管輪廓清晰可見。結(jié)論:1、成功構(gòu)建了重組克隆載體pUCm-T/canstatin和分泌型真核表達(dá)載體pSecTag2B/canstatin。2、陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)重組分泌型真核表達(dá)質(zhì)粒pSecTag2B/canstatin轉(zhuǎn)染進(jìn)入CHO-K1細(xì)胞，人canstatin基因在mRNA水平獲得瞬時(shí)表達(dá)，該C