多基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其表達(dá)產(chǎn)物的亞細(xì)胞定位.pdf

1、[目的]構(gòu)建一種多基因真核表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)同一載體單一啟動(dòng)子的調(diào)控下表達(dá)多個(gè)基因以及這些基因的表達(dá)產(chǎn)物在同一細(xì)胞不同細(xì)胞器中的定位，為腫瘤和自身免疫性疾病的多基因聯(lián)合治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和方法。
　　 [方法]以口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV)和馬鼻炎A病毒(Equine thinitis A virus，ERAV)中2A肽為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)合成一段包括2個(gè)2A肽和不同限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)的多肽序

2、列(5’-ATG-NheⅠ-KpnⅠ-F2A-XhoⅠ-E2A-EcoRⅠ-TAA-BamHⅠ-3’)，分別含起始密碼子ATG、限制性?xún)?nèi)切酶NheⅠ、KpnⅠ、F2A肽，XhoⅠ、E2A肽、EcoRⅠ、終止密碼子TAA以及BamHⅠ位點(diǎn)，整個(gè)序列長(zhǎng)度為168 bp，合成序列用NheⅠ和BamHⅠ酶切后插入pcDNA3.1(-)Myc/His B真核表達(dá)載體中，即構(gòu)建成功pcDNA3.12A。然后將帶有膜定位的紅色熒光蛋白(ERFP)、核

3、定位的綠色熒光蛋白(EGFP)和胞漿定位的黃色熒光蛋白(EYFP)順序插入2A肽之間的位點(diǎn)中，構(gòu)建多基因真核表達(dá)載體pcDNA3.1 ERFP-EGFP-EYFP。用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染小鼠成纖維NIH3T3細(xì)胞。24h和48h后，利用流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡和共聚焦顯微鏡檢測(cè)各種熒光蛋白的表達(dá)及其亞細(xì)胞定位。
　　 [結(jié)果]轉(zhuǎn)染24小時(shí)后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，可同時(shí)檢測(cè)到EGFP和ERFP的表達(dá)，EGFP平均表達(dá)率為68.85%，ERFP平均

4、表達(dá)率為62.59%，兩種熒光蛋白的表達(dá)率比較接近，統(tǒng)計(jì)學(xué)無(wú)明顯差異；熒光顯微鏡下可同時(shí)觀察到綠色熒光和紅色熒光；共聚焦顯微鏡下觀察到在單一細(xì)胞上同時(shí)顯示三種熒光，ERFP定位在細(xì)胞膜上，EGFP主要定位在細(xì)胞核中，而EYFP主要定位于細(xì)胞漿中。
　　 [結(jié)論]通過(guò)串聯(lián)方式將多個(gè)2A肽和基因置于同一個(gè)開(kāi)放讀碼框中可實(shí)現(xiàn)在同一啟動(dòng)子的調(diào)控下表達(dá)多個(gè)基因。此外，在每個(gè)基因序列中加入不同的信號(hào)肽序列可將相應(yīng)基因同時(shí)靶向不同的細(xì)胞器，實(shí)