陰道毛滴蟲ap65基因表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)產(chǎn)物免疫效應(yīng)初探.pdf

1、目的： 通過(guò)構(gòu)建原核表達(dá)載體，獲得陰道毛滴蟲黏附蛋白65基因重組融合蛋白，分析免疫原性及免疫反應(yīng)性，檢測(cè)重組蛋白免疫動(dòng)物后體內(nèi)免疫指標(biāo)，為后續(xù)動(dòng)物免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)及致病機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。 方法： 1、原核表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)、純化及鑒定 分離并純化培養(yǎng)陰道毛滴蟲臨床分離株，提取其總RNA，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)其全長(zhǎng)序列基因，T-A克隆測(cè)序后，連接表達(dá)載體pET-28a(+)。在Ecoli(DE3)plysS宿主菌

2、中用不同濃度IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，采用Ni-NTA親和層析法提純AP65，SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)和提純效果，采用兔抗陰道毛滴蟲全蟲多抗鑒定其免疫反應(yīng)性。 2、兔抗陰道毛滴蟲重組蛋白AP65的多克隆抗體的制備、純化及鑒定 采用日本大耳兔多次免疫重組蛋白AP65后，用飽和硫酸銨法和nproteinAsepharose4FF柱純化多克隆抗體，間接ELISA先摸索抗原的最適包被濃度，后檢測(cè)其血清抗體效價(jià)，western-b

3、lot檢測(cè)免疫原性。 3、免疫效應(yīng)的初探 融合蛋白免疫清潔級(jí)BALB/c小鼠于2、4、6周血清IgG、IgA抗體產(chǎn)生情況及未次免疫流式細(xì)胞檢測(cè)CD4+/CD8+表達(dá)，不同濃度融合蛋白刺激BALB/c小鼠脾細(xì)胞后，檢測(cè)72小時(shí)后上清IFN-r、IL-2、IL-4、IL-6四種細(xì)胞因子的表達(dá)情況。 結(jié)果： 1、pET-28a(+)原核表達(dá)載體的構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá) 克隆ap65基因與GenBank公布基因同

4、源性高，在1mmol/LIPTG誘導(dǎo)下，AP65產(chǎn)量可占細(xì)菌總蛋白量的23％，提純后蛋白純度達(dá)到89.6％，且重組蛋白AP65能與兔抗陰道毛滴蟲全蟲抗體發(fā)生特異性結(jié)合，重組蛋白且有良好的免疫反應(yīng)性，成功地構(gòu)建了陰道毛滴蟲ap65基因的原核表達(dá)系統(tǒng)。 2、兔抗AP65融合蛋白的多克隆抗體的制備及鑒定 第三次加強(qiáng)免疫后，硫酸銨法純化多克隆抗體純度達(dá)到56％，而后采用親合層析柱nproteinAsepharose4FF再次純化

5、多克隆抗體達(dá)到80％，間接ELISA檢測(cè)抗原的最適包被濃度為6.0μg/ml，血清效價(jià)達(dá)到1:25600。western-blot鑒定重組蛋白AP65能與兔抗重組蛋白AP65多克隆抗體結(jié)合，成功地制備了抗陰道毛滴蟲重組蛋白AP65高效價(jià)、高純度多克隆抗體。 3、免疫效應(yīng)的初探 熒光標(biāo)記CD4+/CD8+流式檢測(cè)比值較正常對(duì)照組有升高，血清抗體IgG、IgA在免疫6周后，比正常對(duì)照組OD值有明顯升高，脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液IFN

6、-r、IL-2表達(dá)量較正常對(duì)照組沒有明顯差異，而IL-4、IL-6表達(dá)量明顯高于對(duì)照組。 結(jié)論： 本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建原核表達(dá)載體pET28(+)-ap65,誘導(dǎo)表達(dá)出與理論大小相一致的重組蛋白，經(jīng)Ni-NTA親和層析法純化，制備出高純度的融合蛋白，免疫日本大耳兔后，通過(guò)硫酸銨法和親合層析法可獲得高純度的多克隆抗體，間接ELISA檢測(cè)血清，效價(jià)達(dá)到滿意效果。融合蛋白能明顯誘導(dǎo)脾細(xì)胞表達(dá)IL-4和IL-6兩種細(xì)胞因子，具統(tǒng)計(jì)學(xué)意