人嗜酸粒細(xì)胞親合素（Eotaxin）系列N端突變體及其原核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá).pdf

1、背景： 嗜酸粒細(xì)胞在變應(yīng)性炎癥局部募集和活化、以及嗜酸粒細(xì)胞釋放的炎癥介質(zhì)的作用導(dǎo)致了變應(yīng)性鼻炎發(fā)生。嗜酸粒細(xì)胞在炎癥局部的募集是由趨化因子介導(dǎo)。Eotaxin是作用最強(qiáng)的嗜酸粒細(xì)胞趨化因子，其通過與表達(dá)于嗜酸粒細(xì)胞表面的惟一受體CCR3結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)作用。研究已表明采用抗CCR3抗體等阻斷CCR3-Eotaxin軸的作用可緩解變應(yīng)性疾病。對(duì)野生型-Eotaxin結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)性的研究顯示。EotaxinN氨基末端在其與受體結(jié)

2、合后的信號(hào)傳導(dǎo)中起重要作用。突變其N氨基末端將極大地改變Eotaxin的生物學(xué)活性，并可望獲得具有與CCR3結(jié)合能力而不能引起相應(yīng)信號(hào)傳導(dǎo)的CCR3拮抗劑。理論上，由于CCR3是Eotaxin的惟一受體，Eotaxin突變體拮抗CCR3的作用強(qiáng)、特異性高。 目的： 本實(shí)驗(yàn)擬通過基因操作技術(shù)，獲得人嗜酸粒細(xì)胞親合素Eotaxin基因，構(gòu)建系列的EotaxinN端突變體及其原核表達(dá)載體，為進(jìn)一步純化和檢測(cè)其生物學(xué)活性，篩選C

3、CR3拮抗劑做準(zhǔn)備。 方法： 1、從脾臟提取總RNA，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增編碼人Eotaxin全長(zhǎng)cDNA序列，然后將目的片段克隆至T載體(pTZ57R)，得到重組質(zhì)粒PT-Eotaxin，重組質(zhì)粒用Eotaxin特異性引物進(jìn)行PCR鑒定，并用內(nèi)切酶KpnI，XhoI進(jìn)行雙酶切鑒定，最后送上海博亞生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列分析。 2、根據(jù)PT-Eotaxin的序列，使用突變引物設(shè)計(jì)軟件，針對(duì)Eotaxin成熟鏈N末端

4、設(shè)計(jì)8對(duì)特異性點(diǎn)突變引物，用點(diǎn)突變的方法，在PT-Eotaxin的基礎(chǔ)上用Met替代(單個(gè))EotaxinN-端肽氨基酸殘基，突變PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌XL1-Blue后用氨芐青霉素篩選，獲得突變體重組子(Met-Eotaxins)，選取陽(yáng)性克隆進(jìn)行序列分析。 3、根據(jù)突變體重組子-Met-Eotaxins成熟鏈部分序列，自行設(shè)計(jì)5對(duì)特異性引物，擴(kuò)增野生型及各突變體的成熟鏈片段，使用定向克隆技術(shù)將目的片段克隆到原核表達(dá)載體pET

5、30a(+)上，重組子用卡那霉素進(jìn)行篩選，陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒后用T7引物做PCR鑒定，內(nèi)切酶KpnI，XhoI進(jìn)行雙酶切鑒定，最后進(jìn)行序列測(cè)定，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒(pET30a(+)-Eotaxin，pET30a(+)-Met-Eotaxins)。 4、將鑒定正確的9個(gè)重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化表達(dá)型宿主菌E.coliBL21(DE3)，經(jīng)篩選后即得特異性表達(dá)Eotaxin和Met-Eotaxins成熟鏈融合蛋白的工程菌。將單克隆工程菌接種到

6、50ml含有卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，37℃搖菌培養(yǎng)到對(duì)數(shù)中期(OD600=0.5～1.0)，加入IPTG繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)1～6h，收集菌體。對(duì)誘導(dǎo)產(chǎn)物分別進(jìn)行SDS-PAGE和Western-Blot分析。 結(jié)果： 1.重組質(zhì)粒PT-Eotaxin，用Eotaxin特異性引物進(jìn)行PCR鑒定，以及用內(nèi)切酶KpnI，XhoI進(jìn)行雙酶切鑒定，PCR護(hù)增片段與酶切片段實(shí)際大小均與理論大小一致；序列分析結(jié)果與.genbank對(duì)照，完全

7、符合。 2.突變體重組子(Met-Eotaxins)序列分析結(jié)果經(jīng)對(duì)照發(fā)現(xiàn)，我們得到的突變體與設(shè)計(jì)完全一致。 3.重組表達(dá)質(zhì)粒(pET30a(+)-Eotaxin，pET30a(+)-Met-Eotaxins)用特異性引物(T7)進(jìn)行PCR鑒定，以及用內(nèi)切酶KpnI，XhoI進(jìn)行雙酶切鑒定，PCR擴(kuò)增片段與酶切片段實(shí)際大小均與理論大小一致，序列分析結(jié)果表明，各重組表達(dá)質(zhì)粒中，Eotaxin與Met-Eotaxins的核苷

8、酸序列完全正確，讀碼框無(wú)移位。 4.重組表達(dá)質(zhì)粒誘導(dǎo)產(chǎn)物SDS-PAGE分析結(jié)果表明，各重組表達(dá)質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物中均有相應(yīng)的融合蛋白表達(dá)，而且各重組融合蛋白表達(dá)水平較高，表達(dá)量可達(dá)總蛋白量的32～35.5％。進(jìn)一步Western-Blot分析表明，各融合蛋白均能和特異性Eotaxin一抗結(jié)合，證實(shí)所表達(dá)的確系目的蛋白。 結(jié)論： 本實(shí)驗(yàn)成功克隆了Eotaxin基因，成功的構(gòu)建了一系列EotaxinN末端的突變體重組