重組人TRAIL及突變體的原核表達(dá)和抗腫瘤生物活性研究.pdf

1、中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院博士后學(xué)位論文重組人TRAIL及突變體的原核表達(dá)和抗腫瘤生物活性研究姓名：關(guān)良申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士后專業(yè)：神經(jīng)生物學(xué)指導(dǎo)教師：劉少君20020301中文摘要腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TNF—relatedapoptosis—inducing1igand，TRAIL，也稱為Apo一2L)是wiley1995年首次克隆成功的～種新的抗腫瘤細(xì)胞因子，屬于TNF家族的一個(gè)成員，在人體的多種組織中如脾、肺、前列腺、胸

2、腺和外周血淋巴細(xì)胞等正常組織均可發(fā)現(xiàn)其表達(dá)。人TRAIL蛋白編碼281個(gè)氨基酸，它的基因位于染色體3q26。TRAIL與目前發(fā)現(xiàn)的TNF家族的其它主要成員，如TNF_a，TNF—B(也稱為淋巴毒素或LT—n)，淋巴毒素一B(LT—B)，4lBBL，OX40L，CD27L，CD30L，CD40L和FasL(CD95L，也稱為Apo—lL)等配體均為II型膜蛋白，可水解形成可溶性同源三聚體，參與調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)的許多重要生物功能。TRAIL除了在

3、免疫調(diào)節(jié)和炎性反應(yīng)方面起重要的作用外，還與TNF家族中的TNF—a、TNF—B、FasL配體可導(dǎo)致易感細(xì)胞凋亡。TRAIL與這些配體的區(qū)別在于，除可特異性導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡外，不損傷正常細(xì)胞。這些細(xì)胞因子的跨膜受體含有死亡結(jié)構(gòu)閩，與配體結(jié)合導(dǎo)致引起凋亡的一系列蛋白酶反應(yīng)。本研究首先對(duì)合成的TRAIL寡核苷酸全長(zhǎng)進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)和純化，獲得了有活性的TRAIL蛋白，并驗(yàn)證其抗腫瘤效應(yīng)。同時(shí)采用分子模建方法，對(duì)TRAIL結(jié)構(gòu)進(jìn)行了缺失突變，

4、得到了兩個(gè)突變體，并對(duì)它們進(jìn)行了熱誘導(dǎo)表達(dá)，以便深入的研究結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，為TRAIL開發(fā)成新的抗腫瘤藥物打下基礎(chǔ)。1人TRAIL寡核苷酸全長(zhǎng)合成及在大腸桿菌中表達(dá)和純化人TRAIL寡核甘酸全長(zhǎng)843個(gè)堿基，我們對(duì)其分段合成，然后進(jìn)行全長(zhǎng)拼接，并改變其中的30個(gè)密碼子，以糾正氨基酸偏性，更利于在原核載體中進(jìn)行表達(dá)。核苷酸自動(dòng)測(cè)序結(jié)果，與預(yù)想的序列一致。合成的產(chǎn)物亞克隆至pGEx一2T質(zhì)粒構(gòu)成TRAIL—pGEX一2T，然后轉(zhuǎn)染受體菌D