人miR-147a真核表達(dá)載體的構(gòu)建及對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、侵襲的影響.pdf

1、miRNA(microRNA)是真核細(xì)胞重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，在細(xì)胞及生物的增殖凋亡、發(fā)育分化等過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其功能異常可以導(dǎo)致多種病理狀態(tài)，包括腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。很多腫瘤中均發(fā)現(xiàn)了特異性的表達(dá)異常的miRNAs。目前認(rèn)為，許多miRNAs在腫瘤發(fā)生過(guò)程中，或者作為抑癌基因下調(diào)原癌基因的活性，或者作為癌基因下調(diào)抑癌基因的活性，或者作為腫瘤轉(zhuǎn)移調(diào)節(jié)因子發(fā)揮作用，其自身突變、缺失、易位及相互調(diào)控異常等還可導(dǎo)致相關(guān)基因異常表達(dá)，因此mi

2、RNA在人類(lèi)腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，并可作為腫瘤診斷的新型分子標(biāo)記物。miRNA在肺組織的發(fā)育中起重要作用，其異常表達(dá)與肺癌的進(jìn)展過(guò)程具有密切的關(guān)系，因此篩選、鑒定肺癌特異的miRNA并闡明其在肺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的分子機(jī)制對(duì)于肺癌的診斷、預(yù)后和靶向治療有相當(dāng)大的應(yīng)用價(jià)值。我們?cè)谇捌诠ぷ髦?，利用miRNA芯片分析9-順維甲酸對(duì)肺癌細(xì)胞株A549miRNA表達(dá)譜的影響，發(fā)現(xiàn)9-順維甲酸可上調(diào)miR-147a兩倍以上，并經(jīng)實(shí)時(shí)熒光

3、定量PCR證實(shí)，由此推測(cè)miR-147a可能具有腫瘤抑制作用。據(jù)此，我們構(gòu)建了miR-147a的表達(dá)載體pSilencer-147a，并對(duì)其在肺癌細(xì)胞A549中的表達(dá)和功能進(jìn)行初步研究。
　　 目的:
　　 構(gòu)建人miR-147a真核表達(dá)載體，檢測(cè)其在肺腺癌細(xì)胞A549中的表達(dá)以及對(duì)A549細(xì)胞增殖能力、侵襲能力的影響。
　　 方法:
　　 1.重組質(zhì)粒載體pSilencer-147a的構(gòu)建:以A549細(xì)

4、胞總RNA為模板，RT-PCR擴(kuò)增miR-147a的前體序列(pri-mir-147a)，插入表達(dá)載體pSilencer-CMV neo，構(gòu)建pSilencer-147a重組載體。
　　 2.qRT-PCR直接檢測(cè)外源性miR-147a的表達(dá):A549細(xì)胞接種到25ml培養(yǎng)瓶中，使用X-tremeGENE HP轉(zhuǎn)染試劑，將pSilencer-147a轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，pSilencer空載體作對(duì)照。48h后收集細(xì)胞提取RNA，q

5、RT-PCR檢測(cè)外源性miR-147a的表達(dá)。
　　 3.重組質(zhì)粒載體pMIR-147aT的構(gòu)建:人工合成miR-147a的靶序列147aT，插入載體pMIR-REPORTTM Luciferase，構(gòu)建pMIR-147aT重組質(zhì)粒。
　　 4.報(bào)告基因分析間接檢測(cè)miR-147a的表達(dá):將A549細(xì)胞接種到24孔板中，以pSilencer-147a和pMIR-147aT轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，對(duì)照組分別為:
　　 ①

6、轉(zhuǎn)染等量的pSilencer147a和pMIR-REPORT;
　　 ②轉(zhuǎn)染等量的pSilencer和pMIR-147aT;
　　 ③轉(zhuǎn)染等量的pSilencer和pMIR-REPORT。
　　 48h后收集細(xì)胞，裂解后檢測(cè)它們的相對(duì)熒光素酶活性。
　　 5.MTT分析檢測(cè)外源性miR-147a過(guò)表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞增殖能力的影響:將A549細(xì)胞分別進(jìn)行:
　　 ①不做任何處理;
　　 ②只

7、用X-tremeGENE HP轉(zhuǎn)染試劑處理;
　　 ③以X-tremeGENE HP轉(zhuǎn)染pSilencer質(zhì)粒;
　　 ④以X-tremeGENE HP轉(zhuǎn)染pSilencer-147a質(zhì)粒。
　　 然后將處理后的細(xì)胞接種到96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)24～96h，MTT法檢測(cè)其轉(zhuǎn)然后對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響。
　　 6.Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)外源性miR-147a過(guò)表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞侵襲能力的影響:A549細(xì)胞轉(zhuǎn)

8、染后，用無(wú)血清培養(yǎng)基將細(xì)胞接種到Transwell小室中，繼續(xù)培養(yǎng)48h后，擦去未穿過(guò)的細(xì)胞，甲醇固定小室底部已穿過(guò)的細(xì)胞并以吉姆薩染液染色，計(jì)算侵襲效率。
　　 7.pGL4-AP1等重組質(zhì)粒載體的構(gòu)建:人工合成腫瘤信號(hào)應(yīng)答元件AP1，ELK1，cMYC，STAT3，F(xiàn)OXO，TCF，插入載體pGL4.23[luc2/minP] Vector中，構(gòu)建腫瘤信號(hào)應(yīng)答元件-熒光素酶報(bào)告基因重組載體pGL4-AP1，pGL4-ELK1

9、，pGL4-cMYC, pGL4-STAT3, pGL4-FOXO, pGL4-TCF。
　　 8.報(bào)告基因分析檢測(cè)miR-147a對(duì)肺癌相關(guān)腫瘤信號(hào)途徑的影響:轉(zhuǎn)染前一天，A549細(xì)胞接種于48孔板，以X-tremeGENE HP分別將pGL4-AP1，pGL4-ELK1，pGL4-cMYC，pGL4-STAT3，pGL4-FOXO，pGL4-TCF重組載體與pSilencer-147a進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，同時(shí)進(jìn)行pSilencer空

10、載體和pGL4-AP1，pGL4-ELK1，pGL4-cMYC，pGL4-STAT3，pGL4-FOXO，pGL4-TCF的共轉(zhuǎn)染作為對(duì)照。轉(zhuǎn)染48h后收集細(xì)胞，檢測(cè)其相對(duì)熒光素酶活性。
　　 結(jié)果:
　　 1.構(gòu)建的pSilencer-147a重組質(zhì)粒，經(jīng)限制性酶切和DNA測(cè)序證實(shí)構(gòu)建成功。
　　 2.pSilencer-147a轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后，qRT-PCR檢測(cè)到明顯的外源性miR-147a表達(dá)。

11、　　 3.構(gòu)建的pMIR-147aT重組質(zhì)粒，經(jīng)限制性酶切和DNA測(cè)序證實(shí)構(gòu)建成功。
　　 4.報(bào)告基因分析結(jié)果證實(shí)，pSilencer-147a可在A549細(xì)胞中有效表達(dá)功能性的miR-147a。
　　 5.MTT結(jié)果顯示，miR-147a過(guò)表達(dá)可明顯抑制A549細(xì)胞的增殖，轉(zhuǎn)染48h，72h，和96h后，與對(duì)照組相比抑制效果分別達(dá)到13％，18％和30％。
　　 6.Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR

12、-147a過(guò)表達(dá)可明顯抑制A549細(xì)胞的侵襲能力，轉(zhuǎn)染48 h后，與pSilencer4.1陰性對(duì)照組細(xì)胞相比，實(shí)驗(yàn)組侵襲至Transwell小室底膜下表面的細(xì)胞數(shù)減少了72％。
　　 7.構(gòu)建的pGL4-AP1,pGL4-ELK1,pGL4-cMYC,pGL4-STAT3,pGL4-FOXO,pGL4-TCF重組質(zhì)粒，經(jīng)限制性酶切和DNA測(cè)序證實(shí)構(gòu)建成功。
　　 8.報(bào)告基因分析結(jié)果顯示miR-147a過(guò)表達(dá)可顯著下調(diào)