DEC1真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、目的：
　　 胃癌是目前世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率均居全球和我國(guó)第二位。胃癌的發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制一直是生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)問(wèn)題，轉(zhuǎn)錄因子的異?？赡軈⑴c其發(fā)生發(fā)展。
　　 分化型胚胎軟骨發(fā)育基因1(Differentiated embryo-chondrocyte expressed gene1，DEC1)是bHLH蛋白家族的一個(gè)成員，是廣泛表達(dá)于大多數(shù)正常組織含有堿性螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，并調(diào)節(jié)

2、著機(jī)體正常的生理節(jié)律、自身免疫以及免疫細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。DEC1啟動(dòng)子區(qū)域包括數(shù)個(gè)GC盒，5'端有多個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，其中包括cAMP元件以及多個(gè)E-box元件。DEC1廣泛表達(dá)于大多數(shù)正常組織，并參與細(xì)胞的增殖、分化、腫瘤的發(fā)生和免疫調(diào)節(jié)。生長(zhǎng)因子、UV、營(yíng)養(yǎng)、低氧、感染及激素可以調(diào)控DEC1基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)DEC1在很多腫瘤細(xì)胞系如白血病、結(jié)腸癌、肺腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腎癌中存在高表達(dá)。DEC1蛋白由412個(gè)氨基酸組成，廣泛表達(dá)于大

3、多數(shù)正常組織，可通過(guò)結(jié)合靶基因啟動(dòng)子的E-box序列或通過(guò)蛋白-蛋白之間的相互作用發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性。
　　 本研究以胃癌MGC-803細(xì)胞為研究對(duì)象，采用pGEM-T作為載體，構(gòu)建pcDNA3-DEC1真核表達(dá)質(zhì)粒，利用脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)增加胃癌細(xì)胞MGC-803株DEC1基因的表達(dá)，觀察過(guò)表達(dá)后胃癌細(xì)胞中DEC1表達(dá)水平，并探討DEC1對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響，結(jié)合相關(guān)研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)胃癌腫瘤治療的新思路。
　　 方法：<

4、br>　　 1.復(fù)蘇，培養(yǎng)胃癌MGC-803細(xì)胞株，至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期并傳代。
　　 2.提取人胃癌MGC-803細(xì)胞總RNA，并擴(kuò)增獲得DEC1基因。
　　 3.構(gòu)建pcDNA3-DEC1真核表達(dá)質(zhì)粒，脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染MGC-803細(xì)胞。將細(xì)胞分為pcDNA3-DEC1組、pcDNA3組（陰性對(duì)照）、空白對(duì)照組。
　　 4.RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后3組MGC-803細(xì)胞中DEC1mRNA的表達(dá)。
　　 5.We

5、stern Blot方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后3組MGC-803細(xì)胞中DEC1蛋白的表達(dá)。
　　 6.MTT、免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后3組MGC-803細(xì)胞的增殖情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.經(jīng)鑒定成功構(gòu)建pcDNA3-DEC1真核表達(dá)質(zhì)粒。
　　 2.RT-PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染MGC-803后DEC1mRNA水平比陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組明顯增高。
　　 3.Western Blot方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染MGC-803

6、后DEC1蛋白表達(dá)水平比陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組明顯增高。
　　 4.四甲基偶氮唑藍(lán)法(MTT)、ki-67細(xì)胞免疫化學(xué)試驗(yàn)顯示過(guò)表達(dá)DEC1后MGC-803增殖較對(duì)照組明顯。
　　 結(jié)論：
　　 1.構(gòu)建的pcDNA3-DEC1真核表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定和測(cè)序分析，證實(shí)與設(shè)計(jì)一致。
　　 2.脂質(zhì)體介導(dǎo)pcDNA3-DEC1真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入胃癌細(xì)胞MGC-803增強(qiáng)了DEC1mRNA和蛋白水平的表達(dá)。