CASK過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其對(duì)INS-1細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響.pdf

1、目的：高血脂及高血糖所誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)是β細(xì)胞功能損傷的重要誘因，表現(xiàn)為細(xì)胞的增殖、凋亡和胰島素分泌功能的障礙。轉(zhuǎn)錄因子FOXO1是這一損傷通路中的關(guān)鍵分子。鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性絲氨酸蛋白激酶(calcium/calmodulin-dependent serineprotein kinase，CASK)是其重要的下游靶基因，通過(guò)其不同的結(jié)構(gòu)域與多種膜蛋白及下游效應(yīng)分子相互作用來(lái)行協(xié)調(diào)胞質(zhì)和胞核中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。在胰島和胰島細(xì)胞中有豐富

2、的CASK基因的表達(dá)，但功能尚不清晰。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建CASK基因過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，進(jìn)一步轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的大鼠INS-1細(xì)胞并進(jìn)行功能鑒定，觀察CASK過(guò)表達(dá)質(zhì)粒對(duì)INS-1細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響。
　　方法：1.利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建CASK過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N2-CASK。2.體外培養(yǎng)大鼠INS-1細(xì)胞，用脂質(zhì)體Lipofectamine2000將構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒及對(duì)照組空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染INS-1細(xì)胞，Western blot檢測(cè)CASK

3、蛋白表達(dá)變化，鑒定表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建是否成功。3.轉(zhuǎn)染CASK過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后，定量PCR檢測(cè)p21基因表達(dá)的變化。4.轉(zhuǎn)染CASK過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后，MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)INS-1細(xì)胞增殖的變化，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)INS-1細(xì)胞周期的改變。
　　結(jié)果：1.重組質(zhì)粒測(cè)序證實(shí)與插入序列完全一致，融合蛋白pEGFP-N2-CASK在INS-1細(xì)胞中成功表達(dá)。2.轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后，p21 mRNA水平呈時(shí)間依賴性升高(P<0.01)。3.轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒24h后，IN