APC蛋白不同功能區(qū)域真核表達載體的構建及其對人結直腸癌細胞中β-catenin表達的影響.pdf

1、近年來的科學研究發(fā)現(xiàn)，超過90％的結直腸癌的發(fā)生與經典的Wnt/β-catenin信號通路的激活密切相關，該通路異常激活的標志是β-catenin的穩(wěn)定和在細胞核內的積聚。在結直腸癌細胞中，Wnt/β-catenin信號的激活主要是因APC基因的突變所導致。超過70％的散發(fā)結直腸癌均存在APC基因突變。大多數(shù)的APC基因體細胞突變都發(fā)生在密碼子1250至1500間，該區(qū)域的APC突變可導致15氨基酸重復序列和20氨基酸重復序列的部分缺失

2、，使其失去正常調控β-catenin表達的功能。 多項研究表明，野生型的APC蛋白導入結直腸癌細胞內，可以降低β-catenin的表達水平。然而由于全長的野生型APC片段較大(大于10kb)，直接用于基因治療的操作性較困難。 目的：本研究旨在通過構建、驗證含有APC蛋白不同功能區(qū)域的重組真核表達載體，研究其功能及其對結直腸癌細胞內β-catenin表達水平的影響，篩選到既可有效降低β-catenin表達水平同時片段長度較

3、小的APC基因片段，為將來的基因治療奠定一定的實驗基礎。 方法：1、根據(jù)APC基因的功能結構以及APC突變簇集區(qū)的特點，使用Primer premier5.0軟件設計7條引物，以含有APC全長cDNA的pBluescript質粒為模板，擴增APC基因特異性的功能區(qū)域片段。將擴增出的APC片段克隆到含有優(yōu)化突變型綠色熒光蛋白的pEGFP-N3載體的N端，構建含有APC功能區(qū)域的重組真核表達載體。2、使用ORF查找器對重組質粒的測序

4、結果進行分析，將返回的翻譯蛋白序列在線protein BLAST，檢測重組質粒表達APC功能區(qū)域和GFP能否融合表達。3、使用脂質體轉染法將重組質粒轉染結直腸癌細胞HCT116和HT-29，通過觀察細胞中綠色熒光蛋白的表達情況來驗證APC功能區(qū)域在細胞內的表達。4、通過RT-PCR進一步驗證重組質粒在HT-29中的表達及轉染效率是否與插入片段的大小及細胞特性密切相關。5、利用Western blot技術檢測重組載體對結直腸癌細胞中β-c

5、atenin表達的影響。以β-actin作內參，使用統(tǒng)計學軟件SPSS13.0對western blot電泳條帶的灰度值進行one-way ANOVA分析。 結果：擴增了5條APC基因特異性的功能區(qū)域片段。構建5個pEGFP-N3-APC結構區(qū)域的重組真核表達載體：pEGFP-N3-APC1(APC aa6-767)、pEGFP-N3-APC2(APC aa1020-1169)、pEGFP-N3-APC3(APC aa1262-

6、2033)、pEGFP-N3-APC4(APC aa1020-2033)、pEGFP-N3-APC5(APC aa1020-1698)。ORF查找器對重組質粒的測序結果分析，重組質粒均可表達APC功能區(qū)域和GFP的融合蛋白，APC蛋白同源性為99％以上，GFP蛋白同源性為100％。通過觀察細胞中綠色熒光蛋白的表達驗證APC功能區(qū)域在細胞內的表達，結果顯示：5個重組真核表達載體轉染HCT116細胞后，細胞中均可見綠色熒光蛋白的表達，熒光觀

7、察顯示轉染效率分別約為pEGFP-N3一APCI50％、pEGFP-N3一APC250％、pEGFP-N3-APC330％、pEGFP-N3-APC430％、pEGFP-N3-APC550％，空載體pEGFP-N380％，證明重組載體構建成功，在細胞內均可表達相應的APC功能區(qū)域。RT-PCR進一步驗證重組質粒在HT-29中的表達，RT-PCR結果顯示，5個重組質粒在HCT116和HT-29細胞中的表達基本一致。轉染效率與插入片段的大小

8、及細胞特性密切相關。Western blot技術檢測重組載體對結直腸癌細胞中β-catenin表達，結果顯示：在HCT116細胞中，條帶灰度值間的差異無顯著性(p>0.05)，重組質粒對細胞內β-catenin的表達無明顯影響。在HT-29細胞中，前四組條帶(分別是未轉染細胞、轉染pEGFP-N3-APC1、轉染pEGFP-N3-APC2和轉染pEGFP-N3-APC3的細胞)灰度值間的差異無顯著性(p>0.05)，而后兩組(轉染pEG

9、FP-N3-APC4和轉染pEGFP-N3-APC5的細胞)的條帶灰度值同前相比，差異有顯著性(p<0.05)。重組質粒pEGFP-N3-APC4和pEGFP-N3-APC5轉染入HT-29細胞后可明顯降低細胞內β-catenin的表達。pEGFP-N3-APC4和pEGFP-N3-APC5相比較而言，pEGFP-N3-APC5的片段長度相對較小。 結論：本實驗研究根據(jù)APC基因的功能結構以及APC突變簇集區(qū)的特點，使用Prim

10、er premier5.0軟件設計7條引物，以含有APC全長cDNA的pBluescript質粒為模板，擴增的5條APC基因特異性的功能區(qū)域片段中，經構建重組、ORF查找器對重組質粒的測序、轉染、功能證實及Western blot技術檢測重組載體對結直腸癌細胞中β-catenin表達的影響，證實5個重組載體構建成功，在細胞內均可表達相應的APC功能區(qū)域。APC功能區(qū)域在細胞內的成功表達，為進一步研究其在細胞內的功能提供了基礎。在West