NIBP在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及其對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、背景和目的:
　　結(jié)直腸癌是臨床最常見的惡性腫瘤之一，在全世界范圍內(nèi)，結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率均處于惡性腫瘤的第3位[1]。在我國(guó)，隨著生活水平的不斷提高，發(fā)病率呈上升態(tài)勢(shì)。結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展是遺傳和環(huán)境等多種因素作用導(dǎo)致多基因改變及其相互作用的結(jié)果，其中涉及到多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，比如NF-κB信號(hào)通路。它們通過NF-kB轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)炎癥和腫瘤相關(guān)的至關(guān)重要的幾個(gè)途徑，影響腫瘤細(xì)胞的生存、血管生成、腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性和侵襲力，從而促

2、進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，抑制細(xì)胞凋亡，并引起腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。
　　NIBP是一種支架蛋白，它將NF-κB經(jīng)典途徑中的關(guān)鍵激活子-IKKβ和非經(jīng)典途徑中的關(guān)鍵酶-NIK連接成為三聚體。研究發(fā)現(xiàn)，NIBP的表達(dá)升高可以促進(jìn)IKKβ及其下游p65的磷酸化，由此推測(cè)，NIBP在NF-κB經(jīng)典途徑中發(fā)揮激活劑的作用[2]。另一方面，抑制NIBP的表達(dá)則能減少由NIK和IKKβ分別介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路的活化。此外，NIBP可能提高由TNF-α

3、刺激引起NF-κB信號(hào)通路的活化從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。最近研究還發(fā)現(xiàn)，NIBP在人結(jié)腸癌組織中的表達(dá)明顯升高，推測(cè)這種升高可能與NF-κB信號(hào)通路的活化有關(guān)，NIBP可能參與腺瘤向腺癌的演變過程[2,4]。
　　因此，本研究以NIBP為研究對(duì)象，檢測(cè)結(jié)直腸癌組織中NIBP、NF-κB活性因子p-p65和c-myc、cyclinD1的表達(dá)，了解其表達(dá)與結(jié)直腸癌的臨床分期及臨床病理關(guān)系。利用基因工程構(gòu)建NIBP基因沉默載體，在體

4、外試驗(yàn)中驗(yàn)證NIBP基因表達(dá)水平變化對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響，探討其在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中的作用和意義。
　　方法:
　　1.采用免疫組化SP法分別檢測(cè)16例正常結(jié)腸粘膜、21例結(jié)直腸腺瘤以及114例結(jié)直腸癌患者結(jié)直腸組織中NIBP、、NF-κB活性因子p-p65、c-myc和cyclinD1的表達(dá)，分析NIBP等在結(jié)直腸癌臨床分期和臨床病理的關(guān)系，推測(cè)其在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移中的作用。
　　2.利用

5、基因工程，以人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116株為研究對(duì)象，設(shè)計(jì)并構(gòu)建人NIBP基因的慢病毒表達(dá)載體pLenti6.3-EGFP-NIBP-miR-1/2/3;另外，同時(shí)還設(shè)計(jì)無關(guān)的序列作為陰性對(duì)照(negative control，NC);人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116作為空白對(duì)照。用NIBP基因干擾的慢病毒及慢病毒陰性對(duì)照病毒液Lenti-EGFP感染靶細(xì)胞、空白細(xì)胞作對(duì)照，抽提細(xì)胞的蛋白，WB檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)，篩選出最佳干擾靶點(diǎn)。目的基因干擾靶

6、點(diǎn)慢病毒Lenti-EGFP-NIBP-miR感染HCT116細(xì)胞后加入BSD(Blasticidin，BSD)進(jìn)行篩選，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染NIBP低表達(dá)的單克隆HCT116細(xì)胞。應(yīng)用QRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，選擇NIBP干擾效率高的穩(wěn)轉(zhuǎn)株細(xì)胞株用于后續(xù)的細(xì)胞功能試驗(yàn)。
　　3.以空白對(duì)照組（blank control，簡(jiǎn)稱CON組，即未轉(zhuǎn)染的HCT116細(xì)胞株）、陰性對(duì)照組（NC組，Lenti-EGFP-miR轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞株

7、）、NIBP低表達(dá)組（NIBP組，Lenti-EGFP-NIBP-miR轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞株）和NIBP低表達(dá)組細(xì)胞加NF-κB經(jīng)典途徑激活劑TNF-α組（NIBPT組）作為研究對(duì)象，采用CCK-8檢測(cè)試驗(yàn)盒檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖能力;流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞周期分布情況;透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況;QRT-PCR和Western Blot檢測(cè)細(xì)胞相關(guān)周期蛋白c-myc和cyclinD1的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:

8、　　1.免疫組化顯示結(jié)直腸癌組織中NIBP、NF-κB活性因子p-p65、c-myc和cyclinD1的陽(yáng)性表達(dá)率均高于結(jié)直腸腺瘤和正常結(jié)腸粘膜組織，P＜0.05;而且NIBP、NF-κB活性因子p-p65、c-myc和cyclinD1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)與腫瘤的分化程度、組織類型、浸潤(rùn)深度、TNM和Duke's分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，P＜0.05。同時(shí)，NIBP、c-myc和cyclinD1與NF-κB活化因子p-p65呈正相

9、關(guān)關(guān)系。
　　2.建立NIBP沉默載體和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞株。我們利用質(zhì)粒載體pLenti6.3-MCS/V5 DEST系列慢病毒表達(dá)載體成功構(gòu)建人NIBP基因的慢病毒表達(dá)載體Lenti-EGFP-NIBP-miR(NIBP)和Lenti-EGFP-miR(NC);經(jīng)酶切、重組克隆及鑒定等，證實(shí)載體構(gòu)建成功。設(shè)計(jì)的NIBP基因1＃，2＃，3＃干擾靶點(diǎn)進(jìn)行慢病毒包裝并感染HCT116細(xì)胞后3個(gè)靶點(diǎn)的敲減效率均非常明顯，NIBP

10、蛋白均沒有出現(xiàn)明顯的條帶。我們選擇了其中的第3＃靶點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選。將這些載體轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞株，放在熒光顯微鏡下觀察，看到綠色熒光;可以篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的單克隆細(xì)胞株;通過QRT-PCR和Western Blot試驗(yàn)證實(shí)NIBP干擾效果滿意，HCT116細(xì)胞NIBP干擾穩(wěn)轉(zhuǎn)株與陰性對(duì)照穩(wěn)轉(zhuǎn)株相比，NIBP干擾效率高。
　　3.NIBP對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響到試驗(yàn)研究:CCK-8試驗(yàn)顯示，NIBP轉(zhuǎn)染細(xì)胞組和NIBPT組的細(xì)

11、胞生長(zhǎng)較空白組和陰性對(duì)照組減慢，P＜0.05;細(xì)胞凋亡檢測(cè)四組細(xì)胞的凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05;細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示NIBP和NIBPT組的細(xì)胞多處于G0/G1期（分別為73.500％±3.061％和70.133％±5.181％），明顯高于HCT116細(xì)胞組和NC細(xì)胞組（55.933％±3.963％和52.000％±2.193％），P＜0.05; NIBP和NIBPT組細(xì)胞的S期分別為6.700％±1.249％和9.467％±

12、4.858％，低于HCT116細(xì)胞組和NC細(xì)胞組（11.300％±3.751％和13.567％±1.563％），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05;NIBP和NIBPT組的細(xì)胞處于G2/M期分別為14.967％±1.041％和16.067％±1.380％，明顯低于HCT116細(xì)胞組和NC細(xì)胞組(29.933％±2.309％和31.200％±2.007％)，P＜0.05;說明NIBP轉(zhuǎn)染后結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡無明顯增加，但其增殖能力下降，而且即使

13、使用NF-κB信號(hào)通路經(jīng)典途徑激活劑TNF-α也不能使其增殖能力恢復(fù)。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)NIBP轉(zhuǎn)染細(xì)胞的凋亡亦無明顯增加。而QRT-PCR和WB的檢測(cè)結(jié)果顯示四組細(xì)胞中c-myc和cyclinD1的表達(dá)無顯著差異。
　　結(jié)論:
　　1、NIBP、p-p65、c-myc和cyclinD1在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)。
　　2、NIBP、p-p65、c-myc和cyclinD1的表達(dá)與腫瘤的分化程度、浸潤(rùn)深度、TNM和Duke'