SDHB在結(jié)直腸癌中的表達及功能研究.pdf

1、研究背景與目的:結(jié)直腸癌是世界上第三大常見的惡性腫瘤，全球每年新發(fā)病例約120萬例，死亡人數(shù)達60萬。在我國，結(jié)直腸癌位居惡性腫瘤死亡率第四位。近年來，我國結(jié)直腸癌的發(fā)病和死亡呈明顯上升趨勢。結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展是一個涉及多基因、多步驟、多階段的復雜過程。80％以上的結(jié)直腸癌是從腺瘤癌變而來，而從腺瘤的發(fā)生至癌變的發(fā)生、發(fā)展，主要涉及癌基因、抑癌基因、錯配修復基因等三類基因的變化。其中抑癌基因的異常在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用，其失

2、活或缺失可導致細胞去調(diào)節(jié)性生長，克隆性擴張。因此，在結(jié)直腸癌病因?qū)W研究中，有必要尋找與其發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的抑癌基因，探討其在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用，進一步從分子水平闡明結(jié)直腸癌的發(fā)病機制，為疾病的早發(fā)現(xiàn)、早診斷和早治療提供重要的理論基礎(chǔ)。
　　本課題組前期研究采用熒光差異雙向電泳技術(shù)構(gòu)建了不同臨床分期結(jié)直腸癌蛋白質(zhì)差異表達譜，發(fā)現(xiàn)琥珀酸脫氫酶(succinatedehydrogenase，SDH)是結(jié)直腸癌發(fā)病過程中一個差異表達蛋白質(zhì)

3、分子，可能具有潛在的抑癌功能。SDH也稱為線粒體復合物(Ⅱ)，定位于線粒體內(nèi)膜，是由A、B、C、D四個亞基組成的異源四聚體，分別由相應(yīng)的核基因編碼。SDH是三羧酸循環(huán)和線粒體呼吸鏈的組成部分，其在細胞能量代謝中起到重要的作用。SDH作為一個抑癌基因，其基因缺陷或表達異常與多種疾病的發(fā)生有關(guān)，如副神經(jīng)節(jié)瘤、嗜鉻細胞瘤、腎癌、胃腸道間質(zhì)瘤、Leigh綜合征等。前期研究中我們利用免疫組化技術(shù)檢測了包含103例病例的結(jié)直腸組織芯片中SDH的表達

4、情況，發(fā)現(xiàn)SDHB蛋白在結(jié)直腸癌組織的表達較正常結(jié)直腸粘膜明顯下調(diào)，且SDHB在低分化結(jié)直腸癌組織中表達較中、高分化癌組織明顯減弱。
　　目前對SDH基因在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用及機制國內(nèi)外尚未見報道。本課題在前期工作的基礎(chǔ)上，擴大樣本量檢測SDHB在低分化結(jié)腸癌組織中的表達以進一步證實SDHB的表達與結(jié)腸癌分化程度的關(guān)系。為了進一步深入研究SDHB基因在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用，我們構(gòu)建了SDHB過表達穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系以明確SD

5、HB基因?qū)Y(jié)腸癌細胞SW620生物學行為的影響。同時研究了SDHB基因?qū)W620細胞基因表達譜的影響。此外，我們從SDHB基因突變和啟動子甲基化兩個方面對SDHB在結(jié)直腸癌中表達下調(diào)的機制進行了探討。
　　方法:本研究在包含32個點陣的低分化結(jié)腸癌組織芯片中應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測了SDHB蛋白的表達。而后采用真核表達載體pIRESneo3構(gòu)建了SDHB基因穩(wěn)定表達載體pIRES-SDHB，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將其導入SW620細胞

6、，建立了SDHB穩(wěn)定轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細胞系。通過細胞生長曲線、平板集落形成、裸鼠移植瘤形成試驗等明確SDHB對結(jié)腸癌細胞生長與增殖的作用。通過流式細胞儀檢測SDHB對SW620細胞周期的影響，同時采用Western blot及免疫細胞化學法分別檢測細胞周期相關(guān)分子cyclin D1和PCNA的表達。通過構(gòu)建人全基因組表達譜芯片探究了SDHB基因過表達對SW620細胞基因表達譜的影響。此外，提取了40對結(jié)直腸癌及配對的癌旁正常結(jié)直腸粘膜組織gD

7、NA，一方面采用PCR擴增了SDHB基因各外顯子片段，產(chǎn)物純化后進行雙向測序檢測各外顯子突變情況;另一方面將gDNA經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾后，采用甲基化特異性PCR檢測SDHB基因啟動子甲基化狀態(tài)。
　　結(jié)果:(1) SDHB在結(jié)直腸癌組織中的表達
　?、倜庖呓M織化學檢測SDHB蛋白在結(jié)直腸癌組織芯片中的表達，發(fā)現(xiàn)SDHB在結(jié)直腸癌組織的表達較正常結(jié)直腸粘膜明顯下調(diào)，且其在低分化結(jié)直腸癌組織中表達較中、高分化明顯減弱。
　　

8、②Western blot檢測SDHB蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達，發(fā)現(xiàn)SDHB在結(jié)直腸癌組織中表達正常粘膜組織明顯減弱。
　　(2) SDHB基因轉(zhuǎn)染對結(jié)腸癌SW620細胞生物學功能的影響
　?、偌毎L曲線顯示轉(zhuǎn)染SDHB基因顯著抑制了SW620細胞的生長。
　?、谄桨寮湫纬稍囼烇@示轉(zhuǎn)染SDHB基因顯著抑制SW620細胞的集落形成能力。
　　③裸鼠移植瘤形成實驗表明SDHB抑制結(jié)腸癌SW620細胞致瘤性。

9、r>　?、芰魇郊毎麅x檢測發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SDHB基因?qū)е耂W620細胞周期發(fā)生G1-S期阻滯。
　?、軼estern blot及免疫細胞化學法檢測發(fā)現(xiàn)SDHB下調(diào)SW620細胞中cyclin D1及PCNA的表達。
　　(3) SDHB對結(jié)腸癌細胞基因表達譜的影響
　　①采用Illumina公司的人全基因組表達譜芯片（Human HT-12 v4）共篩選出受SDHB基因調(diào)控結(jié)腸癌SW620細胞中差異表達的基因共1653個，

10、其中上調(diào)基因1382個，下調(diào)基因271個。
　?、诓捎胷eal-time PCR驗證了部分差異表達基因，結(jié)果與芯片檢測結(jié)果一致，說明芯片數(shù)據(jù)可靠。
　?、跥O分析發(fā)現(xiàn)差異表達基因主要參與細胞周期及其調(diào)控、細胞增殖調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細胞信號傳導等過程。
　?、躃EGG數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)差異表達基因主要參與p53、MAPK、Toll樣受體、ErbB、Jak-STAT、T細胞受體、Notch、Wnt、TGF-β、VEGF、細胞因子

11、相互作用等信號傳導途徑。
　　(4) SDHB在結(jié)直腸癌組織中表達下調(diào)的機制
　?、貾CR擴增SDHB基因各外顯子片段，測序后發(fā)現(xiàn)在40例結(jié)直腸癌和與配對的正常結(jié)直腸粘膜組織標本中SDHB基因第一外顯子第18個堿基處存在一個SNP位點，堿基由C顛換成A，致第6位密碼子由GCC變?yōu)镚CA，兩個密碼子均編碼丙氨酸，為一同義突變;未發(fā)現(xiàn)致病性突變。結(jié)果提示SDHB基因外顯子突變可能不是單純性結(jié)直腸癌的致病原因。
　?、贛SP

12、法未能在上述40對組織中檢測出SDHB基因啟動子區(qū)CpG島甲基化，推測SDHB在結(jié)腸癌組織中表達下調(diào)可能不是由啟動子區(qū)甲基化引起的。
　　結(jié)論:(1) SDHB在結(jié)直腸癌組織中表達下調(diào)，且表達水平與結(jié)直腸癌組織分化程度相關(guān)，在低分化癌組織中表達較中、高分化癌組織明顯減弱。
　　(2)SDHB可抑制體外SW620細胞的生長與增殖，誘導細胞G1-S期阻滯;抑制SW620細胞裸鼠皮下移植瘤的形成。
　　(3) SDHB基因外