ACY-1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及作用機(jī)制.pdf

1、背景
　　結(jié)直腸癌為目前世界上最為常見的惡性腫瘤之一，其在消化道惡性腫瘤發(fā)病率中僅次于胃癌和食道癌。在我國(guó)，結(jié)直腸癌的發(fā)病率在近二十年來呈逐漸上升趨勢(shì)，且發(fā)病人群的年齡逐漸趨于年輕化。隨著我國(guó)居民的飲食結(jié)構(gòu)以及生活方式的改變，結(jié)直腸癌的發(fā)病率在城市居民中增高尤其明顯。結(jié)直腸癌具有高發(fā)病率、高死亡率以及高轉(zhuǎn)移率的特點(diǎn)，因此對(duì)人類生命健康構(gòu)成了巨大威脅。盡管隨著現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)水平的不斷發(fā)展和完善，在對(duì)結(jié)直腸癌的治療上已經(jīng)取得了突破性進(jìn)展

2、，但結(jié)直腸癌患者生存率依然未得到明顯改善。結(jié)直腸癌患者的生存率與其診斷時(shí)所處的惡性化程度之間存在相關(guān)性，即Ⅰ期結(jié)直腸癌患者的五年生存率可高達(dá)93％，而Ⅲ期結(jié)直腸癌患者的5年生存率則僅為8％。引起結(jié)直腸癌患者死亡的大部分原因是由于腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，目前臨床上通過手術(shù)為主的綜合治療方法僅能夠使約50％的結(jié)直腸癌患者在術(shù)后三年內(nèi)無進(jìn)展生存，但約有大于40％的結(jié)直腸癌患者在術(shù)后發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，而且結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)的高峰期往往集中在術(shù)后2年左右。因此，尋

3、找與結(jié)直腸癌發(fā)生以及惡性化進(jìn)程相關(guān)的分子標(biāo)志物，同時(shí)對(duì)其相關(guān)功能及作用機(jī)制進(jìn)行深入探索是目前醫(yī)學(xué)界研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)內(nèi)容，對(duì)于結(jié)直腸癌患者的早期檢測(cè)、治療以及預(yù)后情況判斷具有十分重要的意義。
　　結(jié)直腸癌的惡性化過程通常是由體內(nèi)外多種因素參與的多步驟的復(fù)雜過程，通過網(wǎng)絡(luò)性調(diào)控影響結(jié)直腸癌的生物學(xué)行為。隨著腫瘤分子生物學(xué)探索的不斷深入，越來越多的基因被證實(shí)參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展過程。氨基?；?（aminoacylase-1，AC

4、Y-1）為一種胞質(zhì)酶，能夠使細(xì)胞內(nèi)蛋白的N末端肽鏈上的α?；被岚l(fā)生乙?；?，在此過程之后能夠使該蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性增強(qiáng)。當(dāng)機(jī)體內(nèi)的原癌基因活化或者抑癌基因失活時(shí)，細(xì)胞的生長(zhǎng)以及分化過程將發(fā)生失控，從而向癌細(xì)胞轉(zhuǎn)變。目前對(duì)于ACY-1的研究大部分集中在其具有的酰化氨基酸水解酶的活性作用方面，臨床上通常將血清ACY-1作為判斷腎移植預(yù)后的指標(biāo)，但依然缺少其在惡性腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中作用的研究。目前已有研究表明，ACY-1在多種實(shí)體惡性腫瘤組織

5、中的表達(dá)量發(fā)生下調(diào)，從而提示ACY-1可能參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。還有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，ACY-1在神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者的血清中呈低表達(dá)狀態(tài)時(shí)往往預(yù)示著患者的預(yù)后情況較差。但目前尚未有對(duì)于ACY-1在結(jié)直腸癌中表達(dá)以及作用機(jī)制的報(bào)道。
　　轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)為一個(gè)在人體多種生理病理過程具有生物學(xué)功能的生長(zhǎng)因子超家族，主要功能是調(diào)控細(xì)胞增殖以及分化過程，同時(shí)還在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。除此之外，TGF-β還具有促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的形成

6、以及調(diào)控機(jī)體免疫反應(yīng)等功能。TGF-β共包括6種異構(gòu)體(TGF-β1～6)，其中TGF-β1最為常見，幾乎參與了生物機(jī)體內(nèi)所有的病理以及生理過程，與臨床上多種疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β在惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展、胚胎發(fā)育、細(xì)胞外基質(zhì)的形成以及免疫調(diào)節(jié)過程中均扮演著十分重要的角色。目前已有研究證實(shí)，TGF-β1在乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、宮頸癌以及膀胱癌等惡性腫瘤組織中呈異常高表達(dá)狀態(tài)，且其表達(dá)水平與上述腫瘤的進(jìn)展以

7、及轉(zhuǎn)移相關(guān)。
　　細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular regulated kinase，ERK)為絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedprotein kinase，MAPK)家族的重要成員之一。MAPK通路能夠被多種因素刺激而活化，其中包括細(xì)胞因子、神經(jīng)遞質(zhì)、生長(zhǎng)因子、激素、細(xì)胞應(yīng)激以及細(xì)胞黏附等，其下游靶基因包括多種蛋白激酶、磷脂酶和轉(zhuǎn)錄因子等。當(dāng)這些下游靶基因被活化之后能夠直接使核轉(zhuǎn)錄因子以及其他

8、蛋白激酶等底物發(fā)生磷酸化，從而對(duì)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄過程進(jìn)行調(diào)控，最終影響機(jī)體細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、分裂，從而維持其正常生理功能的完整性。ERK1和ERK2是MAPK/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的兩個(gè)重要成員，主要對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分化、凋亡等生理過程進(jìn)行調(diào)控，同時(shí)在細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化過程中亦扮演著重要角色。由ERK所介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路受到來自于細(xì)胞內(nèi)外多種絲裂原的刺激和應(yīng)激，從而使ERK的底物活化，最終實(shí)現(xiàn)調(diào)控細(xì)胞周期以及抑制細(xì)胞凋亡的作用，同時(shí)還能夠促

9、進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移以及侵襲等生理病理過程。ERK1/2在生物機(jī)體細(xì)胞內(nèi)分布產(chǎn)生變化往往預(yù)示著MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的功能狀態(tài)發(fā)生改變。研究表明，在未受到刺激的細(xì)胞中，ERK1/2大部分均存在于細(xì)胞質(zhì)中;當(dāng)細(xì)胞受到刺激時(shí)，部分ERK1/2向細(xì)胞核中聚集，從而形成p-ERK1/2。p-ERK1/2能夠與細(xì)胞核內(nèi)的多種轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生相互作用，從而促進(jìn)了癌基因的表達(dá)。ERK1/2信號(hào)通路與惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展存在顯著相關(guān)性。
　　目的
　

10、　本研究通過檢測(cè)ACY-1在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)，明確其臨床意義，同時(shí)對(duì)其在結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲以及轉(zhuǎn)移過程中的相關(guān)作用機(jī)制進(jìn)行研究，旨在探討ACY-1與結(jié)直腸癌發(fā)生和發(fā)展的相關(guān)性，從而為尋找新的腫瘤分子標(biāo)志物以及藥物作用靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。
　　方法
　　(1)采集132例結(jié)直腸組織樣本均來自于山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院胃腸外科2015年6月～2016年6月結(jié)直腸癌手術(shù)切除組織樣本，按照性別進(jìn)行劃分，其中男性為70例，女性為6

11、2例;按照年齡進(jìn)行劃分，其中≤50歲為57例，＞50歲為75例;按照是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移進(jìn)行劃分，其中發(fā)生轉(zhuǎn)移的為52例，未發(fā)生轉(zhuǎn)移的為80例;TNM分期進(jìn)行劃分，其中Ⅰ期為44例、Ⅱ期為62例、Ⅲ期+Ⅳ為26例。另外選取120例健康志愿者血清作為對(duì)照組。采集上述入選者的癌組織、相應(yīng)癌旁正常組織或血清，分別運(yùn)用熒光定量PCR、western blot法以及ELISA法檢測(cè)ACY-1 mRNA及其蛋白的表達(dá)，并分析其與患者性別、年齡、TNM分期

12、和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。
　　(2)將攜帶有siRNA-ACY-1基因的慢病毒載體GV218-EGFP-ACY-1轉(zhuǎn)染人293T細(xì)胞，待包裝出病毒之后將之感染人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞，以此構(gòu)建ACY-1過抑制表達(dá)HT29細(xì)胞系。用倒置熒光顯微鏡對(duì)人293T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行觀察。熒光定量PCR檢測(cè)ACY-1表達(dá)抑制的HT29細(xì)胞中ACY-1 mRNA的表達(dá);運(yùn)用Transwell小室法檢測(cè)該細(xì)胞系的侵襲能力;流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞的凋亡情況

13、，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性。
　　(3)分別將siRNA-NC和siRNA-ACY-1轉(zhuǎn)染HT-29細(xì)胞，運(yùn)用western blot法分別檢測(cè)ACY-1抑制表達(dá)的人結(jié)腸癌細(xì)胞HT29細(xì)胞中p-ERK1/2和TGF-β1蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果
　　(1)熒光定量PCR檢測(cè)表明，ACY-1 mRNA在癌旁相應(yīng)正常組織（對(duì)照組）中的表達(dá)量為0.324±0.012，在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)量為0.614±0.051，顯著

14、高于對(duì)照組（P＜0.05）。western blot檢測(cè)結(jié)果表明，ACY-1蛋白在癌旁相應(yīng)正常組織中的表達(dá)量為0.231±0.065，在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)量為0.646±0.038，顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。ELISA檢測(cè)結(jié)果表明，癌旁正常組織中ACY-1的含量為36.88±5.65 pg/mL，結(jié)直腸癌患者血清中的含量為57.11±6.32 pg/mL，明顯高于健康志愿者(P＜0.05)。對(duì)ACY-1的表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病

15、例參數(shù)的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果表明ACY-1的表達(dá)與結(jié)直腸癌患者的性別和年齡之間無顯著相關(guān)性（P＞0.05），而與TNM分期和是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P＜0.05)。
　　(2)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明，構(gòu)建的ACY-1抑制表達(dá)HT29細(xì)胞中的ACY-1 mRNA的表達(dá)量明顯低于對(duì)照組，表明成功構(gòu)建ACY-1抑制表達(dá)HT29細(xì)胞系。CCK-8檢測(cè)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染siRNA-ACY-1后細(xì)胞的增殖活性明顯低于對(duì)照組（P＜0.01）。流

16、式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，ACY-1抑制表達(dá)的HT29細(xì)胞的凋亡細(xì)胞數(shù)量顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)。Transwell檢測(cè)結(jié)果表明，感染siRNA-ACY-1后HT29細(xì)胞的侵襲能力顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。
　　(3)western blot法檢測(cè)結(jié)果表明，對(duì)照組ACY-1蛋白的相對(duì)表達(dá)量為0.78±0.11，siRNA-ACY-1組為0.16士0.04。與對(duì)照組相比，siRNA-ACY-1組ACY-1蛋白的表達(dá)量明顯低于

17、對(duì)照組（P＜0.01）。對(duì)照組p-ERK1/2蛋白的相對(duì)表達(dá)量為0.89±0.13，TGF-β1蛋白為0.78±0.14; siRNA-ACY-1組p-ERK1/2蛋白的相對(duì)表達(dá)量為0.33±0.09，TGF-β1蛋白為0.21±0.06。與對(duì)照組相比，p-ERK1/2、TGF-β1蛋白的表達(dá)量均顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論
　　ACY-1在結(jié)直腸癌組織中呈高表達(dá)，且其表達(dá)量與結(jié)直腸癌患者的TNM