構(gòu)建shRNA真核表達(dá)載體沉默NOTCH1基因?qū)θ橄侔㎝CF-7細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、目的:通過構(gòu)建靶向Notch1基因的shRNA真核表達(dá)載體，探討小干擾RNA干擾技術(shù)沉默Notch1基因表達(dá)對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞生物學(xué)的影響。
　　 方法:根據(jù)Genebank提供NOTCH1基因序列，遵循siRNA設(shè)計原則，設(shè)計2條干擾序列，退火后分別克隆到含BamHⅠ及HindⅢ雙酶切位點的pGsensil表達(dá)載體中，并進行雙酶切、測序鑒定。用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將2個shRNA真表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染到乳腺癌MCF-7細(xì)胞中。采用R

2、T-PCR方法檢測轉(zhuǎn)染前后乳腺癌細(xì)胞中NOTCH1基因mRNA表達(dá)的變化，篩選出干擾效率最強的shRNA。將篩選出的干擾效率最強的shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到MCF-7細(xì)胞。運用RT-PCR、Western Blotting及MTT分別檢測干擾阻斷Notch1信號通路前后MCF-7細(xì)胞的RNA、蛋白質(zhì)及細(xì)胞增殖的變化。
　　 結(jié)果:重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ及HindⅢ雙酶切后形成條帶與預(yù)計值一致，插入序列經(jīng)基因測序與設(shè)計序列相符。與正常對照

3、組相比轉(zhuǎn)染pGenesil-NOTCH1-shRNA1、轉(zhuǎn)染pGenesil-NOTCH1-shRNA2的MCF-7細(xì)胞中NOTCH1基因mRNA的表達(dá)明顯降低(p＜0.05)。其中pGenesil-NOTCH1-shRNA2的干擾效果最強。將干擾效率最強的pGenesil-NOTCH1-shRNA2重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞后，采用RT-PCR及Western Blotting檢測Notch1基因的mRNA及蛋白表達(dá)均下調(diào)(p＜0