RNAi沉默MACC1基因表達(dá)對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖和遷移的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:化學(xué)合成針對(duì)結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1(metastasisassociated in colon cancer1，MACC1)的小干擾RNA(smallinterfering RNA，siRNA)，將其轉(zhuǎn)染人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7，觀察MACC1表達(dá)受抑制后，結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1(MACC1)對(duì)MCF-7細(xì)胞的增殖、遷移以及遷移相關(guān)蛋白S100A4和vimentin的影響。
　　方法:(1)將MACC1基因設(shè)計(jì)3個(gè)干擾序列和1個(gè)

2、陰性對(duì)照序列。(2)將3對(duì)MACC1-siRNA和1對(duì)陰性對(duì)照siRNA(negative controlsiRNA，NC-siRNA)轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的MCF-7細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48h后采用RT-PCR檢測(cè)MACC1mRNA的表達(dá)，將干擾效率最高的MACC1-siRNA用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。(3)實(shí)驗(yàn)分為3個(gè)組別:CON組（MCF-7空白對(duì)照組），NC組(MCF-7轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照的siRNA)和siRNA組（MCF-7轉(zhuǎn)染目的siRNA）。(4)采用MT

3、T法觀察3組細(xì)胞的增殖狀態(tài)。(5)Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)3組細(xì)胞的遷移能力。(6) Western blot檢測(cè)遷移相關(guān)蛋白S100A4和vimentin的表達(dá)。
　　結(jié)果:(1) MACC1基因在乳腺癌MCF-7細(xì)胞高表達(dá)。(2)倒置熒光顯微鏡顯示各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，當(dāng)siRNA轉(zhuǎn)染試劑(ul):siRNA(ug)為5∶1時(shí)，MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染的效率最高，達(dá)85％以上。RT-PCR電泳結(jié)果顯示:MACC1-siRN

4、A1-3組MACC1 mRNA較正常對(duì)照組，表達(dá)水平分別下降了80.6％、31.8％、27.2％，提示MACC1-siRNA1的干擾效率最高。(3)針對(duì)MACC1基因的siRNA轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞48h后，siRNA組與空白對(duì)照組比，能夠顯著抑制MACC1蛋白合成，抑制效率為75％。(4)MACC1特異性siRNA轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞24、48、72h后，MTT結(jié)果顯示與空白對(duì)照組比較，siRNA組能夠抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，并隨著時(shí)間延長(zhǎng)效果顯著

5、(P＜0.05)，將陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組比，兩組的差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。(5)轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞48h后，Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示siRNA組與空白對(duì)照組比較，穿過(guò)小室細(xì)胞數(shù)明顯降低，其能有效抑制MCF-7細(xì)胞遷移(P＜0.05)，將空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。(6) siRNA組與空白對(duì)照組相比，遷移相關(guān)蛋白S100A4和vimentin表達(dá)降低(P＜0.05)，將空白對(duì)照組和陰