小鼠Myostatin基因表達(dá)載體的構(gòu)建及體外表達(dá)鑒定.pdf

1、目的：
　　 隨著現(xiàn)代生活習(xí)慣的改變和生活質(zhì)量的提高，很多人開始胖起來，肥胖癥已漸漸成為危害全球人類健康的重要疾病，與2型糖尿病、高血壓、心腦血管疾病、脂代謝異常、胰島素抵抗、非酒精性肝病、哮喘以及關(guān)節(jié)炎等等多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。脂肪細(xì)胞中脂質(zhì)的過度積聚是肥胖癥形成其中的中心環(huán)節(jié)，多種因素參與過程其中，但是發(fā)病機(jī)制還不完全清楚，因此關(guān)于此方面的研究，對肥胖癥的防治有重要意義并逐漸成為熱門的課題。1997年美國基因?qū)W家發(fā)現(xiàn)肌

2、肉生長抑素(Myostatin)及其基因(MSTN)，對肌肉生長具有抑制作用，目前研究者普遍認(rèn)為肌肉是全身最大的耗能組織之一，肌肉生長抑素的缺乏可導(dǎo)致肌肉異常增生，同時(shí)可能出現(xiàn)肌肉耗能增加，從而調(diào)控能量的分配，對認(rèn)識肥胖的發(fā)病機(jī)制可能有重大的意義。本研究擬用質(zhì)粒構(gòu)建技術(shù)及基因表達(dá)技術(shù)，構(gòu)建該基因的表達(dá)載體，期待用于觀察MSTN基因過表達(dá)對肥胖小鼠體重、內(nèi)臟脂肪含量、糖脂代謝等的影響，進(jìn)而進(jìn)一步通過該工具觀察探討MSTN與肥胖癥的關(guān)系。<

3、br>　　 方法：
　　 1、小鼠MSTN蛋白表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-mMSTN的構(gòu)建：
　　 1.1、mMSTNcDNA插入片段的擴(kuò)增：從ICR小鼠肌肉組織中提取總RNA，經(jīng)RT-PCR，獲得大量拷貝的MSTNcDNA，然后插入pEASY-T1克隆載體中，經(jīng)BamHⅠ、ApaⅠ雙酶切后，獲得帶有酶切位點(diǎn)的小鼠MSTN表達(dá)序列片段。
　　 1.2、載體片段的獲得：以pcDNA3.1(+)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化TOP1

4、0感受態(tài)細(xì)菌，得到該質(zhì)粒的大量拷貝后，大量提取，經(jīng)BamHⅠ、ApaⅠ雙酶切后，進(jìn)行瓊脂糖電泳回收，獲得用于構(gòu)建mMSTN表達(dá)質(zhì)粒的載體片段。
　　 1.3、應(yīng)用T4DNA連接酶，將帶有酶切位點(diǎn)的mMSTN擴(kuò)增片段，與pcDNA3.1(+)質(zhì)粒酶切以后的載體片段進(jìn)行連接，構(gòu)建成pcDNA3.1(+)-mMSTN質(zhì)粒。
　　 2、pcDNA3.1(-)-mZAG表達(dá)質(zhì)粒的體外鑒定：應(yīng)用陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法將pcDNA3.1

5、(+)-mMSTN質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到小鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞中,48h后收集細(xì)胞提起RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，用real-timePCR方法觀察細(xì)胞中MSTN的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 1．成功克隆小鼠MSTNcDNA全序列，并將其與pcDNA3.1(+)載體片段連接，構(gòu)建成pcDNA3.1(+)-mMSTN表達(dá)質(zhì)粒。
　　 2．在體外培養(yǎng)的小鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞系中，證實(shí)MSTN表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3